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基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用的制作方法
本发明公开一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。通过基因重组得到的RMP16,与天然TNF-α相比,在血液中具有更高的稳定性和生理活性,可显著抑制前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562、宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞的生长,对DU145的抑制效果尤为突出,且可抑制显著Du145细胞移植瘤的生长,其药效学作用与雌莫司汀相似,Du145细胞移植瘤裸鼠,结果显示,重组多肽RMP16的毒副作用明显小于雌莫司汀,无明显的毒副作用表现。该基因重组TNF-α衍生物RMP16可应用于制备具有如下功能的药物:治疗前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。
【专利说明】基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】,特别涉及一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]TNF-α是较早发现的、研究最为深入的肿瘤坏死因子家族成员之一,抗肿瘤作用强,参与多种生理病理过程的调节。人
TNF-α为单拷贝基因,定位在第六号染色体上(6Ρ12-13),与MHC基因群紧密连锁;TNF-,由4个外显子和3个内含子组成。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成,包括由第1、2号外显子编码的76个氨基酸残基的信号肽;切除信号肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α,为157个氨基酸残基,相对分子量为17kDa.。其中第69位和101位为两个半胱氨酸,可形成分子内二硫键,对维持其空间结构有重要意义。
[0003]TNF-α作为一种蛋白类因子,其生物学活性主要是通过和细胞膜上特异受体结合实现的。TNF-α有两种受体,(tumornecrosisfactorreceptorI,TNFRI),(tumornecrosisfactorreceptorII,TNFRII)。两类TNFR均为跨膜糖蛋白,氨基酸序列分析显示这两种受体的胞外结构域的序列高度相似,都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列;但是胞内结构域却差异很大,TNFRI胞内段含有死亡结构域(deathdomain,DD),而TNFRII没有DD。TNFRI在大多数种类细胞的表面都表达,且大部分生物学功能是由TNFRI介导,包括杀细胞、抗病毒、诱导ICAM-1及IL-6的表达、促进成纤维细胞增殖、激活
NF-KB等。TNFRII主要传递胸腺细胞和NK细胞等淋巴细胞的增殖信号,通过促进TNF-α与TNFRI结合而增加TNFRI诱导的作用。根据细胞及其微环境的不同,激活TNFRI后可通过激活不同的信号途径介导细胞增殖、凋亡、坏死性凋亡等程序。
[0004]TNF-α具有很好抗肿瘤作用,被认为是最具潜质的癌症治疗药物。但TNF-α在体内易被肾快速排泄和被各种蛋白酶分解,很不稳定,半衰期较短(15-30min)。若希望达到疗效,则必须频繁注射大剂量TNF-α,进而导致严重的不良反应,甚至引起休克死亡。TNF-a的上述缺陷,严重限制了其实际临床应用,
[0005]研究表明,小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、无免疫原性、结构简单、易于穿透肿瘤细胞等特点,已成为肿瘤药物研发的新热点。这些都预示着小分子TNF-α衍生物在临床方面将有良好的应用前景。设计高稳定性、高生物活性的TNF-α衍生物,特别是能与血浆中的载体蛋白结合的小分子TNF-α衍生物,可提高其生物利用度,发挥天然TNF-α抗肿瘤的同时,也极大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的药用价值和产业化前景。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种基因重组TNF-α衍生物RMP16。该衍生物
RMP16具有更高稳定性和更高生物活性。
[0007]本发明的另一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法。该制备方法根据TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性,设计RMP16在原核表达系统的基因序列,采用基因工程技术,结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽RMP16的高效制备;该制备方法生产效率高,生产成本低。
[0008]本发明的再一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的应用。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种基因重组TNF-α衍生物RMP16,其氨基酸序列如下所示:MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。
[0010]编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列为:
[0011]ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG;
[0012]所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法,包括以下步骤:
[0013](I)设计并合成RMP16基因:
[0014]采用3条引物两步法合成RMP16基因:
[0015]引物Fl:
[0016]5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’;
[0017]引物F2:
[0018]5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’;
[0019]引物F3:
[0020]5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’;
[0021]其中,CATATG为NdeI酶切位点,GCTCTTCCGCA为SapI酶切位点;GGTGGT和CCACCAT为保护碱基;
[0022]首先将引物Fl和引物F2进行链延伸反应,然后以其产物为DNA模板,以Fl和F3为引物,PCR反应制得RMP16基因;
[0023](2)构建重组载体pTXBl-RMP16:
[0024]用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXBl和步骤⑴制得的RMP16基因进行双酶切,再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXBl连接,得到重组载体pTXBl_RMP16;
[0025](3)制备表达工程菌pTXBl-RMP16/ER2566:
[0026]用重组载体pTXBl-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌
,得到表达工程菌pTXBl-RMP16/ER2566;
[0027](4)表达和纯化:
[0028]①诱导表达工程菌PTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域(Chitinbindingdomain,CBD)组成的“三元”融合蛋白;
[0029]②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化,“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中,然后含有巯基乙醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中,反应;巯基乙醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割,释放目的多肽;然后用洗脱几丁质柱的溶液洗柱,收集洗脱液;
[0030]③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽,得到基因重组TNF-α衍生物RMP16。
[0031]步骤(1)中所述的链延伸反应的条件优选为:94°C,1min;60°C,5min;,1min;
[0032]步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为:94°C,5min;94°C、30s,60°C、30s,72。。、30s,31次循环;72°C延伸1min;
[0033]步骤⑷②中所述的含有β_巯基乙醇的溶液的组成如下:20mMTris-HCI,,ImMEDTA,50mMβ-巯基乙醇,;
[0034]步骤(4)②中所述的反应的条件优选为23V反应24
小时;
[0035]步骤(4)②中所述的洗脱几丁质柱的溶液的组成优选如下:20mMTris-HCl,500mMNaCI,ImMEDTA,;
[0036]步骤(4)③中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的多肽RMP16的步骤如下:
[0037]A、流动相A为在体积百分比5%乙***(CNCH3,溶质为纯水)中添加三***乙酸(TFA)得到,%;流动相B为100%乙***(CNCH3)中添加三***乙酸(TFA),%;流速lmL/min,30min线性梯度洗脱;
[0038]B、线性梯度洗脱中流动相B由O~58%(v/v),收集目的多肽洗脱峰,光吸收检测波长为218nm;并进行质谱鉴定。
[0039]所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16应用于制备治疗如下疾病的药物:前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。
[0040]所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16应用于制备治疗TNFRI型受体相关疾病的药物,有如下作用:诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期和抑制肿瘤血管生成等作用。
[0041]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0042](I)本发明所制备的基因重组多肽RMP16,是TNF-α衍生物,与天然TNF-α相比,它具有天然TNF-α的活性中心序列
(75~94位氨基酸),因此具有相似的受体激动性,SP高生物活性;同时,重组多肽RMP16克服了天然TNF-α易被各种蛋白酶分解和代谢的缺陷,稳定性高,可结合血浆载体蛋白,体内半衰期长。
[0043](2)基因重组多肽RMP16克服了天然TNF-α由于特定的蛋白结构而存在的副作用,且具有天然TNF-a通过激活受体TNFRI而产生的抗肿瘤作用。
[0044]这些区别使得重组多肽RMP16在生理环境中具有更高的稳定性和对TNFRI受体的激活活性,与TNFRI受体结合后,激活TNF-a信号传导通路,发挥诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期和抑制肿瘤血管生成等作用。
[0045](3)本发明所制备的高稳定性基因重组TNF-a衍生物RMP16在治疗前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性髓原白血病、食管癌等肿瘤中有显著的疗效。
[0046](4)本发明的所述重组多肽RMP16的制备方法效率高、成本低,应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1是RMP16基因合成及重组表达质粒pTXBl_RMP16构建示意图;图中:MCS—多克隆位点;CBD—几丁质结合结构域;intein—内含肽。
[0048]图2是SDS-PAGE检测融合蛋白Intein_CBD-RMP16
表达的鉴定图;其中,泳道I是IPTG诱导前菌体破碎上清液;泳道2是IPTG诱导后菌体破碎上清液。
[0049]图3是制备的重组多肽RMP16的飞行质谱鉴定图。
[0050]图4为制备的重组多肽RMP16对多种肿瘤细胞的生长抑制作用的检测结果图。
[0051]图5为重组多肽RMP16对Dul45移植瘤生长的抑制作用的检测结果图。
[0052]图6为重组多肽RMP16对治疗裸鼠的肝脏(图6A)、肾脏(图6B)的毒副作用检测的病理切片图。
【具体实施方式】
[0053]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
[0054]实施例1
[0055]表达工程菌pTXBl-RMP16/ER2566的构建和表达
[0056]具体步骤如下:
[0057](1)RMP16编码序列的获得:
[0058]按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码RMP16的cDNA,设计3条引物,采用两步法获得该序列(如图1所示):
[0059]引物Fl:
[0060]5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’;
[0061]引物F2:
[0062]5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’;
[0063]引物F3:
[0064]5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’;
[0065]其中,CATATG为NdeI酶切位点,GCTCTTCCGCA为SapI酶切位点;GGTGGT和CCACCAT为保护碱基。
[0066]①链延伸反应:
[0067]反应体系为:引物Fl(250μM/L)2μL,引物F2(250μM/L)2μL,1XTaKaRaBuffer(含有4mmol/LMgCl2)2μL,dNTP2μL,,;
[0068]反应条件为:94°C,1min;降至60°C,5min;72°C,1min;
[0069]得到延伸反应液。
[0070]②PCR反应:
[0071]反应体系为:以延伸反应液为DNA模板,引物Fl(25μM/L)2μL,F3(25μM/L)2μL,,dNTP2μL,10XTaKaRaExBuffer2μL,TaKaRaTaq酶