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基因组中目的基因的遗传改造方法
本发明涉及基因组中目的基因的遗传改造方法。提供了一种新的对基因组中目的基因进行遗传改造(如敲除、定点突变和/或基因敲入等)的方法。本发明的方法操作步骤简单、易于实施,改造准确性高、效率高,并且在改造结束后,基因组中无多余序列残留。
【专利说明】基因组中目的基因的遗传改造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因【技术领域】;更具体地,本发明涉及基因组中目的基因的遗传改造方法。
【背景技术】
[0002]后基因时代的生物学研究迫切需要一种有效的基因功能分析方法。基因遗传改造的应用,为研究基因的功能和寻找新的治疗疾病的干预措施提供了有力支持。针对基因组的基因改造,主要涉及基因的敲除、敲入、替代、点突变等。-manipulation-of-dna-and-protein-examples-from-current-research/site-directed-mutagenesis-using-〇ligonucleotide-based-recombineering的报导中,综述了对大肠杆基因组上特定位点(基因)做改造的一系列方法。
[0003]目前,大肠杆菌基因组改造的主要方法是基于
Red重组的方法。大肠杆菌基因组上进行敲除和导入,主要有PCRtargeting等方法。PCRtargeting法()为常规方法。改造完成后,使用FRT-Flp(或者类似的&e-loxP法)通过位点特异性重组消去抗性。缺点是消抗后残余FRT位点。该样就无法完成完全无痕的效果。如果第二次改造位置临近首次改造的位置,残余的FRT位点会发生相互干扰。其他方法,比如瞻菌体转导,方便性等方面尚不如PCRtargeting法。
[0004]目前大多数的基因组改造方法无法实现基因组的无痕改造。要实现无痕改造,也就是改造后完全不引入额外的序列到基因组,主要方法是利用反筛选标记、单链重组等。反筛选标记法,主要的筛选标记有sacB,thyA等。主要缺点是对细胞有一定限制。sacB的缺点是,如果受体细胞是可利用藏糖生长的(利用藏糖发酵产代谢物),则sacB反筛选效果差。另一个问题是基因较长,转化等操作困难。thyA的缺点是需要先菌株改造为thyA缺陷型。该些缺陷限制了该些方法的使用。另几种实现无痕改造的方法,例如:基于单链重组的方法;Cas/crisper法等,尚无广泛应用的报道。
[0005]I-Scel核酸内切酶法在大肠杆菌中做改造时,现有技术中一种方法是在抗性基因两侧插入正向重复序列,通过正向重复序列之间的单交换同源重组,实现抗性基因的
环出、消去,参见Kim,()和化,.,etal.(2008).NucleicAcidsRes36(14):-stepred-mediatedrecombinationforversatilehigh-;40(2):191-7,该一方案的缺点是设计和实施较为繁琐,需要设计构建的重复序列。
[0006]此外,也可通过引入重组片段,通过双交换替代抗性基因,实现抗性基因的消去。例如,通过再次转化线性片段,实现线性片段替代抗性基因,参见Blank,K.,Hensel,,.(2011).RapidandHighlyEfficientMethodforScarless;,,,,ISSN1932-6203;BMCBiotechnology2007,7:59doi:-6750-7-59;-4930,但是,该种方法效率较低,正确率80%,和/或所述Ac和所述Tc的序列同源性>80%。优选地,所述IY和所述\的序列同源性>90%,和/或所述Ac和所述Tc的序列同源性>90%。更优选地,所述
IY和所述\的序列同源性>95%,和/或所述Ac和所述Tc的序列同源性>95%。
[0029]在另一优选例中,所述1Y和所述\的序列不同,并且与所述IY同源重组的目的基因5'端序列位于与所述\同源重组的插入位置5'端序列的上游,和/或
[0030]所述Ac和所述Tc的序列不同,并且与所述Tc同源重组的目的基因3'端序列位于与所述Ac同源重组的插入位置3'端序列的下游。
[0031]在另一优选例中,所述第一构建物组中包含多种构建物,各构建物的结构如式II至In所示,
[0032]A1l-B-C1-B-A1eII;
[0033]A2l-B-C2-B-A2r12;
[0034]至
[00;35]AnL-B-Qi-B-AnEIn;
[0036]其中n为>2的整数,
[0037]Al^?A化为不同插入位置的5'端同源臂序列;
[003引C1?化为不同的选择性标志基因;
[0039]AIe?An^为不同插入位置的3'端同源臂序列。
[0040]在另一优选例中,所述n可W为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。优选地,所述
n可W为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。更优选地,所述n可W为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0041]在另一优选例中,所述第一构建物组中包含两种构建物,各构建物的结构分别如式II和12所示,
[0042]A1l-B-C1-B-A1eII;
[0043]A2l-B-C2-B-A2r12;
[0044]Al^A2^为不同插入位置的5'端同源臂序列;
[0045]Cl、C2为不同的选择性标志基因;
[0046]A1,、A2,为不同插入位置的3'端同源臂序列;
[0047]将第一构建物组中的两种构建物转化入细胞,并进行同源重组,将B-C1-B和B-C2-B分别插入基因组中。
[0048]在另一优选例中,所述所述第一构建物组中包含H种构建物,各构建物的结构分别如式II至13所示,
[0049]AIl-B-CI-B-AIrII;
[0050]A2l-B-C2-B-A2r12;
[0051]A3l-B-C3-B-A3r13;
[005引A心A2^、A3l为不同插入位置的5'端同源臂序列;
[0053]C1、C2、C3为不同的选择性标志基因;
[0054]Alc、A2c、A3c为不同插入位置的3'端同源臂序列;
[00巧]将第一构建物组中的H种构建物转化入细胞,并进行同源重组,将B-C1-B、B-C2-B、B-C3-B分别插入基因组中。
[0056]在另一优选例中,所述第一构建物组中的各构建物位于同一载体上。
[0057]在另一优选例中,所述第一构建物组中的各构建物位于不同的载体上。
[0058]在另一优选例中,所述第一构建物组中的各构建物通过PCR或者overlapPCR的方式进行制备。
[0059]在另一优选例中,所述第二构建物组中包含多种构建物,各构建物的结构如式III至Iln所示,
[0060]B-TIl-EI-TIr-BIII
[0061]B-T2l-E2-T2e-BIII
[0062]至
[0063]B-IX-En-l'nij-BIIn
[0064]其中n为>2的整数,
[0065]El?化独立地选自;(a)针对不同目的基因的遗传改造片段;(b)无;
[0066]TIl?IX为不同目的基因的5'端同源臂序列;
[0067]TIe?IX为不同目的基因的3'端同源臂序列。
[0068]在另一优选例中,所述n可W为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。优选地,所述n可W为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19或20。更优选地,所述n可W为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0069]在另一优选例中,所述第二构建物组中包含两种构建物,各构建物的结构如式III和II2所示,
[0070]B-TIl-EI-TIr-BIII
[0071]B-T2l-E2-T2e-BII2
[0072]El、E2独立地选自;(a)针对不同目的基因的遗传改造片段;(b)无;
[007引化、T2^为不同目的基因的5'端同源臂序列;
[0074]Tlc、T2c为不同目的基因的3'端同源臂序列;
[00巧]将第二构建物组中的构建物转化(1)的细胞,且在细胞内表达I-Scel核酸内切酶,通过同源重组分别WE1和E2替换目的基因,从而实现对细胞基因组中两个目的基因的遗传改造。
[0076]在另一优选例中,所述第二构建物组中包含H种构建物,各构建物的结构如式III至II3所示,
[0077]B-TIl-EI-TIr-BIII
[0078]B-T2l-E2-T2e-BII2
[0079]B-T3l-E3-T3e-BII2
[0080]El、E2、E3独立地选自;(a)针对不同目的基因的遗传改造片段;(b)无;
[0081]T1l、T2^、T3l为不同目的基因的5'端同源臂序列;
[008引T1k、T2k、T3k为不同目的基因的3'端同源臂序列;
[0083]将第二构建物组中的构建物转化(1)的细胞,且在细胞内表达I-Scel核酸内切酶,通过同源重组分别WE1、E2和E3替换目的基因,从而实现对细胞基因组中H个目的基因的遗传改造。
[0084]在另一优选例中,所述第二构建物组中的各构建物位于同一载体上。
[0085]在另一优选例中,所述第二构建物组中的各构建物位于不同载体上。
[0086]在另一优选例中,所述的方法,通过同源重组在目的基因的5'端上游插入B-C1-B片段,在目的基因的3'端下游插入B-C2-B片段,在细胞基因组中形成"B-C1-B-目的基因-B-C2-B"结构,其中,C1和C2为不同的选择性标志基因;和
[0087]通过同源重组W"E"替换"B-C1-B-目的基因-B-C2-B"片段,从而实现细胞基因组中目的基因的遗传改造。
[0088]在另一优选例中,本发明提供的一种细胞基因组中目的基因的遗传改造方法,包括:
[0089](1)提供构建物1,依次包括(按照5'一3'):目的基因待改造位置5'端同源臂序列-I-Scel酶切位点-选择性标志(selectivemarker)基因-I-Scel酶切位点-目的基因待改造位置3'端同源臂序列;将构建物1转化细胞,W"I-Scel
酶切位点-选择性标志基因-I-Scel酶切位点"插入目的基因待改造位置;
[0090](2)提供构建物2,依次包括(按照5'一3'):I-SceI酶切位点-目的基因待改造位置5'端同源臂序列-目的基因遗传改造片段-目的基因待改造位置3'端同源臂序列-I-Scel酶切位点;将构建物2转化(1)的细胞,且在细胞内表达I-Scel核酸内切酶,通过同源重组目的基因遗传改造片段"替换"I-Scel酶切位点-选择性标志基因-I-Scel酶切位点",从而实现细胞基因组中目的基因的遗传改造。
[0091]在本发明的另一方面,提供一种细胞基因组中目的基因的遗传改造方法,所述方法包括:
[0092](1)在目的基因的5'端上游插入如下构建物a;I-SceI酶切位点-选择性标志基因a-1-SceI酶切位点;在目的基因的3'端下游插入如下构建物b;I-SceI酶切位点-选择性标志基因b-1-SceI酶切位点,在细胞基因组中形成"I-Scel酶切位点-选择性标志基因a-1-SceI酶切位点-目的基因-I-Scel酶切位点-选择性标志基因b-1-SceI酶切位点"结构;
[0093](2)提供构建物2',依次包括(按照5'一3'):I-SceI酶切位点-目的基因5'端上游同源臂序列-目的基因遗传改造片段-目的基因3'端下游同源臂序列-I-Scel酶切位点;将构建物2'转化(1)的细胞,且在细胞内表达I-Scel
核酸内切酶,通过同源重组W"目的基因遗传改造片段"替换"I-Scel酶切位点-选择性标志基因a-1-SceI酶切位点-目的基因-I-Scel酶切位点-选择性标志基因b-1-SceI酶切位点",从而实现细胞基因组中目的基因的遗传改造。
[0094]在另一优选例中,所述目的基因是必需基因。
[0095]在另一优选例中,所述的遗传改造为不带入外源操作元件(包括但不限于;酶切位点、交换位点、抗性位点),W及不带入目的基因遗传改造位置W外的其它基因片段的遗传改造。
[0096]在另一优选例中,所述的选择性标志包括;营养缺陷型标记,抗性标记,报告基因标记。
[0097]在另一优选例中,所述的同源臂序列长度25-30(K)bp;较佳地35-10(K)bp;更佳地40-600bp。
[0098]在另一优选例中,应用包含I-Scel核酸内切酶编码基因的表达载体(辅助质粒)表达I-Scel核酸内切酶。
[0099]在另一优选例中,所述的包含I-Scel核酸内切酶编码基因的表达载体中,W诱导型启动子驱动I-Scel核酸内切酶编码基因诱导型表达。
[0100]在另一优选例中,所述的诱导型启动子包括;鼠李糖启动子(rha)或trc启动子(分别在鼠李糖或IPTG(或乳糖)诱导下启动下游基因表达)。
[0101]在另一优选例中,进行基因组同源重组时,还在细胞内表达