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基于重组ul51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法.docx

上传人:开心果 2023/3/18 文件大小:22 KB

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专利名称:基于重组ul51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法
技术领域:
本发明涉及动物医学领域,特别涉及基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法。
背景技术:
鸭瘟(duckplague,DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病,在世界各养鸭地区都有分布,其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂,而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前,用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验(neutralizationtest,NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法和被动血凝试验。其中经典的方法是血清中和试验,但其敏感性不够理想,且耗时费力,不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点,是DPV感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段;但是,由于DPV全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想,阻碍了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA)的大规模应用。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的鸭瘟病毒抗体检测方法,该方法避免了繁琐的病毒纯化步骤,且操作简单,特异性、灵敏性较高。为实现上述目的,本发明的技术方案为基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法,,用封闭液封闭,洗涤去除未结合的抗原及杂质,得固相抗原;b一抗结合将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释,得稀释血清,即一抗,通过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物,洗涤去除固相载体上杂质;c二抗结合将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释,得酶标二抗稀释液,将所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合,得抗原_抗体_二抗复合物;d显色在步骤c所得抗原_抗体_二抗复合物中加入色原底物避光显色后,加入终止液终止反应得显色样品液;e检测及结果判定将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD45tlnm值,当OD45tlnm值>,。进一步,所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法,其特征在于,,用封闭液封闭,洗涤去除未结合的抗原及杂质,得固相抗原;
b一抗结合将待检血清作等于200倍的稀释,得稀释血清,即一抗,通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物,洗涤去除固相载体上杂质;c二抗结合将酶标二抗作等于2000倍的稀释,得酶标二抗稀释液,将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合,得抗原_抗体_二抗复合物;d显色在步骤c所得抗原_抗体_二抗复合物加入色原底物避光显色后,加入终止液终止反应得显色样品液;e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值,所述OD45tlnm值>,;进一步,步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μL;进一步,步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP;进一步,步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为的牛血清白蛋白溶液;进一步,步骤d中所述色原底物为四***联苯***;进一步,步骤d中避光显色的时间为20分钟;进一步,所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。本发明的有益效果在于本发明基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法,其特异性好,对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)和鸭大肠杆菌()的阳性血清进行检测,结果均为阴性;该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于
10%,能检出经13200倍稀释的DPV阳性血清。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,其中图I-A为DPVUL51基因的PCR扩增M指DL2000相对分子质量标准;1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物;2指以DPVCHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小,约为760bp);图I-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III,1指重组质粒pMD18-UL51用EcoRI和XhoI双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp);图I-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III;1指重组表达载体pET28a_UL51,2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoRI和XhoI双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准;1为阴性对照(未加IPTG诱导);2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD);图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果1-7的IPTG浓度分别为0,,,,,;图2-C为不同温度诱导pET28a_UL51表达结果1_3的温度分别为20、30和37°C;图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果1_8
的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。
图3为重组UL51蛋白的检测(a)SDS-PAGE分析M为蛋白标准(KD);1为发酵培养的全菌液;2为包涵体洗涤法纯化的重组UL51蛋白;3为透析复性后的重组UL51蛋白;(b)Westernblotting分析1是以兔抗DPV抗体为一抗检测重组UL51蛋白(约为34KD)。图4为敏感性试验检测结果。图5为特异性试验结果。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例首先对所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化表达菌并发酵培养,收集到大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀,再通过超声波破碎菌体、重组UL51蛋白包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的;同时,用Westernblotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应;进一步确定了重组UL51蛋白的包被浓度及一抗、二抗的稀释度,从而制备了鸭瘟病毒抗体检测方法。实施例基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及UL51蛋白的纯化1、材料方法以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,,黄培堂等译,科学出版社,
2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。、质粒和毒株质粒pMD18-T,购自大连宝生物工程有限公司;原核表达质粒pET28a(+),Novagen公司产品;、(DE3)和DPVCHv强毒株,由四川农业大学禽病研究中心提供。,其种鸭DPV和抗体均为阴性;兔抗DPV抗体,由四川农业大学禽病研究中心提供。、2X傻瓜PCRMix、DNA连接酶Mix、限制性内切酶EcoRI和Xhol、UltraPure质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPureTMDNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad公司;其它试剂均为分析纯,购自上海生工生物技术有限公司。,参考UL51基因序列(GenBank登录号DQ072725),由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL51F5’-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3,(划线部分为EcoRI位点)引物DPV-UL51R:5,-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3,(划线部分为XhoI位点)。合成后,以适量灭菌去离子水溶解,使其终浓度为20mmol/L,-20°C
保存备用。

IOd日龄健康鸭胚,分别用5%碘酒和75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净,剪去头、翅、腿和内脏,PBS冲洗后将胚体剪成Imm大小的小块,加PBS适量,之后置于三角瓶内,加细胞分散剂(%的胰蛋白酶)15(^1/胚,于371水浴中消化31^11。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min,倾弃上清,细胞沉淀用适量的MEM悬浮后,用5层纱布过滤,向滤液中加入10%小牛血清和100IU/mL双抗后,分装于IOOmL细胞培养瓶中,7mL/瓶,水平静置于37°C细胞培养箱中进行培养。,弃生长营养液,用灭菌PBS清洗细胞表面2次后,加入DPV病毒液23mL覆盖细胞表面进行吸附,37°C吸附120min后弃病毒液,然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液,之后37°C培养。同时做未接毒的DEF对照。⑴选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60%70%的DEF(IOOmL细胞瓶);同时选取细胞形态正常的DEF作对照;(2)倾去细胞培养液,加入500μL的细胞裂解液,同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL,轻轻混勻后,37°C孵育IOmin;(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中,并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物,倒入离心管中;(4)用饱和酚***仿及***仿抽提2次,再用水饱和***处理
2次;(5)加1/10倍体积3mol/LNaAC,混勻后,加入2倍体积冷无水乙醇,-20°C放置3060min;(6)13000r/min离心20min,沉淀用预冷的70%乙醇洗涤两次;(7)真空抽干后,溶于适量TE缓冲液中,加入1μLRNA酶,37°C作用30min,_20°C保存备用。
权利要求
,其特征在于,,用封闭液封闭,洗涤去除未结合的抗原及杂质,得固相抗原;b一抗结合将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释,得稀释血清,即一抗,通过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物,洗涤去除固相载体上杂质;c二抗结合将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释,得酶标二抗稀释液,将所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合,得抗原_抗体_二抗复合物;d显色在步骤c所得抗原_抗体_二抗复合物中加入色原底物避光显色后,加入终止液终止反应得显色样品液;e检测及结果判定将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD45tlnm值,当OD45tlnm值>,。
,其特征在于,,用封闭液封闭,洗涤去除未结合的抗原及杂质,得固相抗原;b一抗结合将待检血清作等于200倍的稀释,得稀释血清,即一抗,通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物,洗涤去除固相载体上杂质;c二抗结合将酶标二抗作等于2000倍的稀释,得酶标二抗稀释液,将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合,得抗原_抗体_二抗复合物;d显色在步骤c所得抗原_抗体_二抗复合物加入色原底物避光显色后,加入终止液终止反应得显色样品液;e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值,所述OD45tlnm值>,所述OD45tlnm(。
,其特征在于步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μL。
,其特征在于步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP。
,其特征
在于步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为的牛血清白蛋白溶液。
,其特征在于步骤d中所述色原底物为四***联苯***。
,其特征在于步骤d中避光显色的时间为20分钟。
,其特征在于所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。
全文摘要
本发明涉及动物医学领域,特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的方法,具体包括固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色及检测并判定等步骤,本方法是基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法,其特异性好,对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌()的阳性血清进行检测,结果均为阴性;该方法的批内或批间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1∶3200倍稀释的DPV疫苗免疫鸭阳性血清。