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专利名称:均相分析物检测的制作方法
技术领域:
本发明涉及测定样品中分析物的存在或其浓度的方法、组合物和试剂盒。
背景技术:
出于诊断和监测疾病的目的,临床化学领域需要测定生物液体中蛋白质、药物、有机体和其它分析物的浓度。例如,心肌梗塞时,(某些)蛋白质从心脏中释放出来。检测这些蛋白质的存在、浓度和其释放的时间过程可帮助诊断心脏病发作。当前在生物液体中检测到的大多数临床相关性蛋白存在的浓度大于I皮克/毫升。例如,前列腺特异性抗原(PSA)是可用于前列腺疾病检测的血清蛋白,其在男性中存在的正常浓度约为0-4纳克/毫升。PSA水平高于4ng/ml可怀疑患有前列腺疾病,尤其是前列腺癌。用常规的免疫检测技术不难检测该浓度范围。然而,切除前列腺之后,PSA的浓度降低到用常规技术检测不到的水平。已切除前列腺的癌症患者中PSA水平增加是癌症复发的指征。需要飞克/毫升灵敏度的实验来监测这些患者。据估计,人类大约有35,000个基因和多达500,000种蛋白质。蛋白质相对于基因的多样性增加可归因于转录后修饰(例如剪接)和翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化)。这些修饰可显著改变蛋白质的功能。因此,即使很细微的差别也可能是临床相关性的。目前在人血浆中只鉴定了
290个蛋白,虽然在2D凝胶中可看到上千个斑点。人血浆蛋白质组可能包括数以十万计的浓度极低以至现有技术难以检测到的蛋白质。目前还没有能够检测到大多数这些蛋白质的方法。临床试验中可用的样品量相对较少增加了检测某些低浓度分析物的困难度。因此,蛋白质分析物的大多数免疫检测依赖于多相方法,例如ELISA(酶联免疫吸附测定),其中将抗体结合的分析物与未结合的分析物物理分离。多相检测方法很复杂,并且需要多个步骤(例如,与固相结合并重复进行洗涤步骤)将结合的分析物与未结合分析物分离。这些步骤导致非特异性结合和灵敏度降低;而且这些步骤费钱费时。因此,需要避免非特异性结合的高灵敏性均相检测。已描述了小分子如药物的均相免疫检测(不需要结合物质和游离物质的物理分离)。这些检测包括SYVA’sFRAT检测、EMIT检测、酶通道免疫检测、和荧光能量转移免疫检测(FETI)(DadeBehring,Deerfield,Illinois);酶抑制物免疫检测(HoffmanLaRoche和AbbottLaboratories):突光偏振免疫检测(Dandlicker),以及其它检测方法。所有这些方法的灵敏度都有限,只有少数几种方法,包括FETI和酶通道检测,适于大的多表位分析物。因此,需要用于检测生物和临床样品中存在的大的和/或复杂的分析物的灵敏的均相方法。发明概述
本发明提供具有第一结合成员和第二结合成员的结合对,所述第一结合成员包含偶联于第一核酸的第一特异性分子,所述第二结合成员包含偶联于第二核酸的第二特异性分子,其中第一和第二核酸形成具有确定和有限的稳定性的双链体(duplex)。在某些实施方式中,第一和第二特异性分子可以是受体、配体或抗体。特异性分子可彼此相同或不同。在一个实施方式中,本发明特异性分子与同一细胞上的两种受体相互作用。在另一个实施方式中,第一和第二特异性分子均为单克隆抗体,它们可与相同抗原上不同的表位相互作用并因此包含夹心对。结合对的第一和第二核酸通常是单链核酸,可以是DNA、RNA或PNA,但也可以是部分双链核酸或其类似物。在本发明某些实施方式中,至少一种核酸是嵌合DNA/RNA分子。本发明的核酸可通过其5’端或3’端偶联。在本发明一方面,结合对中的一条核酸通过其5’端偶联,另一条核酸通过其3’端偶联。核酸间的双链体可在核酸的末端之间形成,或可包含中间核酸序列。在优选实施方式中,核酸适于用PCR、LCR、SDA或TMA扩增。本发明还提供用结合成员检测分析物的方法。根据一个实施方式,将如上所述的结合对与分析物接触形成复合物。然后结合对核酸解离,然后再结合。重新形成的双链体(主要在分析物结合的结合对中发现)经3’延伸之后,通过可通过PCR扩增包含双链体的核酸来检测重新形成的双链体。当PCR引物只结合于通过重新形成的双链体的
3’延伸而产生的位点而不与结合成员本身的核酸结合时,可大大减少背景。可用多种方法中的任意一种检测扩增产物,这些方法包括溴化乙啶染色、银染、放射自显影、斑点印迹、狭线印迹、southern印迹、以及掺入荧光分子、荧光淬灭分子、化学发光化合物、化学发光淬灭分子、生物发光化合物或荧光核苷。在本发明一个实施方式中,结合对核酸之一是DNA/RNA嵌合分子,另一个是DNA分子,两个核酸之间形成的双链体具有短的DNA/DNA杂合区和较长的DNA/RNA杂合区。该实施方式中的完整双链体是稳定的,但可被RNA酶消化而变得不稳定,这进一步减少了不与分析物结合的结合对成员产生的背景。本发明多种实施方式可进行组合以产生兼具特异性和高灵敏度的均相检测试验,用于检测临床相关性蛋白质、病毒和细胞。附图
(content)、构象和总体结合方案。.:1和SEQIDN0.:2的核酸对的双链体形成、3’延伸和PCR扩增的总体方案。.:1和SEQIDN0.:3的核酸对的双链体形成、3’延伸和PCR扩增的总体方案。(热启动)。。,其中一条寡核苷酸[SEQIDN0.:1]通过连接于其3’端的间隔分子(spacer)连接,而另一条寡核苷酸[SEQIDN0.:3]
通过其5’端直接连接。。“R”表示核糖核苷酸碱基的位置,“D”表示脱氧核糖核苷酸碱基的位置,“S”表示间隔分子的位置。
。发明详述应理解,上文的一般性描述和下文的详细描述只是示范性和解释性的,而非限制本发明。本文所用的单数包括复数,除非另有说明。本文所用的“或”指“和/或”,除非另有说明。此外,使用的术语“包括”以及该术语的其它形式是非限制性的。本文所用各节的标题只是出于组织行文的目的,不应理解成限制所述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分,包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册、和论文均全文明确纳入本申请,作为参考文献用于所有目的。定义在进一步描述本发明具体实施方式
之前,要定义和详细描述一些术语。除非另有明确定义,本文所用的相关术语、实验室操作、技术和方法是其所属领域所知的。标准化学符号和缩写可与这些符号所代表的全名互换使用。因此,例如,术语“氢”和“H”理解为具有相同的含义。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制(formulation)、递送以及患者治疗。标准技术可用于重组DNA方法、寡核苷酸合成、组织培养等。如本领域通常可实现的或如本文所述的,可根据生产商的说明书用试剂盒来实施反应和纯化技术。一般可根据本领域熟知的常规方法或如本文说明书全文所引用和讨论的各种一般性或更具体的参考文献中所述的方法来实施上述技术和操作。见,例如
Samtoook等,分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,.(1989)),Harlow&Lane,抗体:实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,.(1988)),全文纳入本文作为参考用于所有目的。本文所用“结合成员”指特异性分子和核酸之间形成的偶联物。含有由结合成员核酸之间形成的、具有确定和有限的稳定性的双链体连接的两个结合成员的组合物称为“结合对”。结合对与分析物组合形成结合对-分析物复合物,本文简单地称为“复合物”。本文所用术语“分析物”指需要在试验中检测以及可能存在于样品中的任何物质。该分析物可以是任何物质而没有限制。在本发明优选实施方式中,分析物包括存在天然抗体或可制备其抗体的物质。分析物可以是例如,蛋白质、多肽、半抗原、糖、脂质、药物、细胞或多种生物或非生物分子中的任何其它物质,它们的复合物或组合。在另一个实施方式中,分析物是核酸。在另一个实施方式中,分析物是抗体。在另一个实施方式中,分析物是细胞(动物、植物、真菌、细菌等的细胞
)或其亚组分或细胞器(如线粒体)。可用本发明组合物、方法和试剂盒检测的多价配体分析物一般是多(氨基酸),即多肽、蛋白质、多糖、核酸,或它们的组合。这些组合包括细胞组分、组织、细菌、病毒、细胞壁、细胞膜、细胞器、染色体、基因、线粒体、核等。根据本发明一方面,某些分析物不含有核酸。可用本发明方法对多种蛋白质分析物进行方便地检测。可将这些蛋白质分析物分类成各蛋白质家族,各家族有类似的结构特征、生物功能、与特定微生物(尤其是致病微生物)的关系等。本发明特别感兴趣的蛋白质家族包括例如,免疫球蛋白、细胞因子、酶、激素、癌抗原、营养标记、组织特异性抗原和生物战争物质。这些蛋白质分析物可存在于血液、血清、血浆、脊髓液、滑膜液、唾液、尿液、细胞或组织。
以下是可用本发明组合物、方法和试剂盒检测的结构相关的蛋白质分析物类别的例子:鱼精蛋白组蛋白白蛋白球蛋白硬蛋白磷蛋白粘蛋白以下是可用本发明组合物、方法和试剂盒检测的人血浆中发现的临床重要性蛋白质的例子:α「脂蛋白α1-抗胰蛋白酶皮质激素传递蛋白
-后白蛋白色氨酸-弱(Tryptophan-poor)α「糖蛋白α1χ-糖蛋白甲状腺素结合球蛋白间-α-胰蛋白酶抑制剂Ge-球蛋白(Ge1-1)(Ge2-1)(Ge2-2)七珠蛋白(Hp1-1)(Hp2-1)(Hp2-2)血浆铜蓝蛋白乙酰胆碱酯酶α2-脂蛋白肌红蛋白
C-反应性蛋白α2-巨球蛋白a2-HS-糖蛋白Ζη-α2-糖蛋白α2-神经氨糖酸糖蛋白促红细胞生成素β_脂蛋白
转铁蛋白血红素蛋白纤维蛋白原纤溶酶原β2_糖蛋白Iβ2_糖蛋白II免疫球蛋白G(IgG)或YG-球蛋白分子式:Y2k2或Y2λ2免疫球蛋白A(IgA)或YA-球蛋白分子式:(α2K2)η或(α2κ2)η免疫球蛋白M(IgM)或YM-球蛋白分子式:(μ2K2)5或(μ2λ2)5免疫球蛋白D(IgD)或YD-球蛋`白UD)分子式:(.)或(.)免疫球蛋白E(IgE)或YE-球蛋白UE)分子式:(ε2κ2)或(ε2λ2)游离κ和λ轻链补体因子:C1IC1IqC'IrC'IsC12C13β^a2DC14C15C16C17C18C19可用本发明组合物、方法和试剂盒检测的重要血液凝固因子包括下表中所列的例子:
权利要求
,其包含:第一结合成员,其含有偶联于第一核酸的5’端的第一特异性分子;和第二结合成员,其含有偶联于第二核酸的3’端的第二特异性分子,其中所述第一和第二核酸形成具有确定和有限的稳定性的双链体,其中所述第一特异性分子是第一抗体,所述第二特异性分子是第二抗体,其中所述抗体结合选自以下的分析物:鱼精蛋白组蛋白白蛋白球蛋白硬蛋白憐蛋白粘蛋白脂蛋白
α1--后白蛋白色氨酸_弱(Tryptophan-poor)O1-糖蛋白α1χ_糖蛋白甲状腺素结合球蛋白间-α-胰蛋白酶抑制剂Ge-球蛋白(Ge1-1)(Ge2-1)(Ge2-2)七珠蛋白(Hp1-1)(Hp2-1)(Hp2-2)血浆铜蓝蛋白乙酰胆碱酯酶α2-脂蛋白肌红蛋白C-反应性蛋白α2-巨球蛋白Ci2-HS-糖蛋白Zn-α2-糖蛋白α2-神经氨糖酸糖蛋白促红细胞生成素β-脂蛋白转铁蛋白血红素蛋白纤维蛋白原纤溶酶原β2-糖蛋白Iβ2-糖蛋白II免疫球蛋白G(IgG)或YG-球蛋白分子式:Y2k2或Υ2λ2免疫球蛋白A(IgA)或YA-球蛋白分子式:(α2κ2)η或(α2K2)η免疫球蛋白M(IgM)或YM-球蛋白分子式:(μ2κ2)5或(μ2λ2)5免疫球蛋白D(IgD)或YD-球蛋白(YD)分子式:(.)或(.)免疫球蛋白E(IgE)或YE-球蛋白UE)分子式:(ε2K2)或(ε2λ2)游离K和λ轻链补体因子:C'IC'IqC'IrC'IsC'2C'3β!Aa2DC'4C'5C'6C'7C'8C'9血液凝固因子1:纤维蛋白原;因子I1:凝血酶原;因子IIa:凝血酶;因子II1:组织凝血致活酶;因子V和V1:促凝血球蛋白原,加速球蛋白;因子VI1:前转化素;因子VII1:抗血友病球蛋白(AHG);因子IX:血小板辅因子II血浆凝血激酶(PTC);因子X=St-P因子,自身凝血酶原
III;因子X1:血浆凝血活酶;因子XII1:血纤维稳定因子;肽和蛋白质激素甲状旁腺激素(甲状旁腺素)甲状腺降钙素胰岛素高血糖素松弛酞促红细胞生成素促黑激素(黑素细胞-刺激激素;垂体中间叶激素)成长激素(生长激素)促肾上腺皮质激素(促皮质素)促甲状腺激素卵胞刺激素促黄体(生成)激素(促间质细胞激素)催乳(Luteomammotropic)激素(催乳素,泌乳素)绒促性素(绒毛膜促性腺激素)组织激素分泌素胃泌素血管紧张素I和II缓激肽人胎盘催乳激素细胞因子ILIIL2IL4IL6IL8ILlOEGFTNFNGF癌抗原PSACEAα--MB肌钙蛋白BNPPro-BNP降钙素髓磷脂碱性蛋白来自神经垂体的肽激素催产素抗利尿激素释放因子(RF)CRFjLRFjTRFj成长激素-RF,GRFjFSH-RF,PIFjMIF蓖麻***白喉(Diptheria)***肉毒杆菌***葡萄球菌肠***B棒状杆菌白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)肺炎球菌月市炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)链球菌酿***链球菌(Streptococcuspyrogenes)唾液链球菌(Streptococcussalivarus)葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhea)肠杆菌(Enterobacteriaciae)大肠菌大肠杆菌(Escherichiacoli)