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报告正文
(1)项目的立项依据。(研究意义、国内外研究现状及发展动态
分析,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民经济和
社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要
参考文献目录)
微生物遗传学的一个基本问题是细菌如何维持和改变自身的基因组大小和结构以适应
不断变化的外界环境[1-3]。已知细菌有多种机制来改变自身基因组大小,如基因丢失、基因
水平转移、基因复制(Duplications)等等[4,5],因此细菌的基因组总是处于不断变化的状
态。如Lukjancenko等人对已公布的61株大肠杆菌基因组序列进行分析[6],发现仅有6%
的基因存在于所有的菌株中,这些基因被称为核心基因(coregenes);而某些菌株中的重
要基因却在另一些菌株中出现缺失。因此,细菌基因丢失(genelossorgenomereduction)
也是细菌基因组进化中的重要过程之一,其动力和机制也是微生物遗传学的研究热点之一。
常见的基因丢失机制主要有两种:同源重组[7]和随机丢失[8,9]。同源重组介导的片段
丢失概率较高,但是必须具有一定的同源序列,如大肠杆菌RecA系统介导的同源重组要不
少于25bp的同源片段[10];猪链球菌中长度为89kb的致病岛在整合酶介导下出现剪切和转
×10-4,其两侧的同源序列长度为15bp[11]。而随机丢失是所有生物DNA复
制过程中都有可能出现的错误,由于细菌中存在多种基因组保护机制,如同源重组系统、非
同源末端连接、错配修复等[12,13],因此,随机丢失的概率是很低的,如伤寒沙门菌出现
×10-9~×10-8左右[1]。
本课题组于2014年报道了一种新的细菌耐受噬菌体现象:铜绿假单胞菌可丢失大片段
基因组DNA从而耐受噬菌体的感染,我们曾将这种机制称为“断臂求生”[14]。以铜绿假
单胞菌宿主菌PA1及其裂解性噬菌体PaP1为模型,分离鉴定耐受噬菌体的突变菌株PA1r,
意外的是耐受菌株PA1r可以分泌红色色素(见“工作基础”图3)。于是我们对敏感株PA1
和耐受菌PA1r进行了全基因组测序和比较基因组学分析,发现PA1r基因组中丢失了一段
。其中hmgA基因的丢失,导致了一种红色底物尿黑酸的积累,而galU
基因的丢失则导致PA1r失去了脂多糖(LPS)。LPS是噬菌体PaP1感染宿主菌的受体,因此
噬菌体无法吸附上PA1r(见“工作基础”图3)。而且,我们通过“彷徨试验”证实,基
因组片段的丢失是出现在噬菌体感染之前的,也就是说噬菌体在这个过程中只是发挥了选:.
择作用,而不是诱导基因组片段的丢失。因此,我们证实细菌可通过丢失自身基因组片段从
而耐受噬菌体。但是,铜绿假单胞菌大片段DNA丢失具有三个显著的特点:(1)基因组
片段丢失的概率(即红色耐受菌出现的概率)非常高,达到(±)×10-6,显著高于
正常细菌基因组片段丢失的概率(10-8~10-9);(2)丢失的片段非常大,约200~300kb;
(3)片段断裂的位点不是特异的:虽然都包括了hmgA和galU两个基因,但是不同红色耐
受菌中的断裂位点是不一致的(图1)。因此,“断臂求生”的机制不符合同源重组和随机
丢失的特点,提示铜绿假单胞菌中大片段DNA的丢失可能是由一种新机制介导。
图
(A)和脉冲场电泳(B)证实4株红色耐受菌(PA1r、PA1R-37、PA1R-57、PA1R-61、)丢失的DNA
片段位点具有显著差异(约200~300kb)。(C):4株红色耐受菌基因组片段丢失的示意图。
我们推测:大片段DNA丢失的第一步是由某种DNA酶剪切导致DNA断裂,随后两个
断点之间的DNA被连接酶连接,而中间的片段则出现丢失(图2)。因此,我们首先从铜绿
假单胞菌中的DNA酶入手。如果此DNA酶缺失,铜绿假单胞菌则不能剪切DNA,则不会
出现大片段DNA的丢失,也不能产生红色耐受菌。反过来,首先要寻找不能产生红色耐受
菌的突变菌株,其缺失的基因可能就是剪切大片段DNA的酶。同时,为了便于今后的同行
交流与合作,我们选择了铜绿假单胞菌国际标准株PAO1进行后续试验。裂解性噬菌体JG004
的受体也是LPS[15],而且PAO1被裂解性噬菌体JG004感染后,也会出现大片段DNA丢
失而产生红色耐受菌,DNA丢失的片段大小和概率均与PA1一致。因此,我们从美国
UniversityofWashingtonGenomeCenter购买了铜绿假单胞菌PAO1的转座子突变文库[16]。
根据PAO1的基因组注释结果,我们筛选了所有可能参与DNA剪切的酶(同源重组系统::.
RecA、RecB、RecC、RecD;非同源末端修复系统(NHEJ):LigD和Ku;错配修复系统(MMR):
MutS、MutL、UvrA/B/C、UvrD;其它推测的核酸酶:XthA、EndA、XseB、XseA、PA4172、
PA4282;详见“工作基础”表1)。将相应的突变菌株分别感染裂解性噬菌体JG004后,鉴
定不能产生红色耐受菌的转座子突变株,那么这个突变株缺失的基因可能就是介导“断臂求
生”的关键基因。通过筛选,我们意外的发现:mutL突变后,PAO1ΔmutL没有再出现红色
耐受菌(见“工作基础”),而其余筛选的转座子突变菌株均可以产生红色耐受菌,这一结果
强烈提示MutL可能是导致DNA大片段丢失的关键酶!
MutL是错配修复系统中的关键酶,其功能在大肠杆菌这一模式生物中被深入研究[12,
13,17]。在大肠杆菌中,MutS首先结合于点突变处,然后募集MutL并形成复合体,该复
合体再激活核酸酶MutH,激活后的MutH可以识别未***化的GATC位点,并在错配位点
处切割单链DNA。然后,核酸外切酶在解旋酶及单链结合蛋白SSB蛋白的协助下,将未甲
基化的GATC至错配位点之间的整段单链DNA去除。随后,DNA聚合酶将以另一条DNA
链为模板进行DNA合成,从而消除错配位点,而且GATC位点可以与错配位点相隔1000bp
以上。但是,这一剪切模式仅存在于部分变形菌门(proteobacteria)的细菌中,在其余细菌
中,MutL兼具核酸酶的作用,因而没有MutH。铜绿假单胞菌中的MutL被证实具有错配修
复功能[18,19],而且体外实验中发现其具有单链DNA剪切功能。然而,MutL是否具有双
链DNA剪切功能还有争议。有报道称,在Mg2+、ATP存在的情况下,枯草芽胞杆菌的
MutL(BsMutL)可以剪切单链DNA;而当加入Mn2+后,则可以剪切双链DNA,导致DNA
双链断裂[20]。但是,尚不清楚铜绿假单胞菌的MutL是否也具有双链DNA剪切功能。由
于缺少直接在细菌中检测MutL剪切双链DNA的方法,因此目前还没有在细菌内证实MutL
剪切双链DNA的报道。
因此,我们提出一种假设:铜绿假单胞菌的MutL具有双链DNA剪切活性,在修复细
菌DNA的点突变时,会有一定的概率在点突变的附近剪切双链DNA。随后,两个点突变
被剪切后,两个DNA断端被连接酶重新连接起来,导致两个断端之间的DN***段丢失。
由于点突变是随机的,因此,这种剪切-重新连接是具有随机性的,筛选的红色耐受菌中大
片段DNA丢失位点的非特异性也支持这一假设。只有当丢失的DN***段同时包含有hmgA
和galU两个基因时,则具有了分泌红色色素和耐受噬菌体的双重特点,经过噬菌体感染可
被识别筛选出来(图2)。
综上所述,本课题在发现铜绿假单胞菌可通过基因组大片段丢失从而耐受噬菌体感染的
工作基础之上,筛选到MutL可能是介导染色体DNA大片段丢失的关键酶,将通过基因敲:.
除、回补试验以及体外双链DNA剪切试验研究MutL在铜绿假单胞菌中剪切双链DNA从
而导致大片段DNA丢失的分子机制。这一研究有望揭示MutL的新功能,也有望提出一种
新的MutL介导的细菌基因组片段丢失机制。
:细菌DNA复制过程中出现点突变,此时MutL结合于点
突变附近,有一定概率出现双链DNA剪切。形成两个DNA双链剪切位点之后,断端两侧的DNA被连接
酶连接,而中间的片段被丢失。当丢失的片段正好包含有hmgA和galU两个基因时,则表现为红色耐受菌。
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(2)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
(此部分为重点阐述内容)
:
(1)铜绿假单胞菌错配修复酶MutL编码基因的敲除实验及验证
1)以pEX18Tc质粒为载体,构建mutL上下游同源序列(即左右同源臂,LA和RA)加
庆大霉素基因(Gm)的基因敲除载体,pEX-LA-Gm-RA。
2)将基因敲除质粒经电击转化至铜绿假单胞菌PAO1中。
3)用噬菌体JG004感染PAO1ΔmutL,将裂解液涂布在LB平板上,鉴定至少1000个噬菌
体耐受菌菌落,观察有无红色菌落形成。重复三次。
(2)铜绿假单胞菌错配修复酶MutL的回补实验及验证
1)将mutL基因克隆于表达载体pUCP24,构建为pUCP-mutL。将表达质粒经电击转化至:.
铜绿假单胞菌PAO1ΔmutL中。
2)用噬菌体JG004感染PAO1ΔmutL::mutL,将裂解液涂布在LB平板上,鉴定至少1000
个噬菌体耐受菌菌落,观察有无红色菌落形成。重复三次。
(3)铜绿假单胞菌MutL双链DNA剪切功能验证
1)铜绿假单胞菌MutL的表达与纯化。
2)纯化后的MutL与超螺旋质粒pBKS共孵育,并调整不同金属离子、离子浓度、孵育时
间等参数,在1%凝胶上进行电泳,观察有无线性化质粒条带的出现。
3)根据MutL中非常保守的核酸酶功能结构域D(Q/M)HA(X)E(X)E,分别构建D467A,
24
H469A,E473A和E478A等4个关键点突变的MutL,表达、纯化后,与超螺旋质粒pBKS
共孵育,电泳观察条带,判断点突变的MutL是否具有双链DNA剪切活性。
(4)大片段DNA断裂位点的结构特点及分析
1)从10次独立重复试验中各筛选一株红色耐受菌,收集10株后分别进行全基因组测序,
鉴定断裂位点序列。
2)针对断裂位点及其前后2kb的序列进行BLAST、NEBcutter和MemeMotif在线分析,
分别查找同源序列、内切酶识别位点和结构域(Motif)。
3)如果发现有特异序列或结构域,通过PCR将该序列引入质粒中,再重复(3)的步骤,
用MutL进行酶切,与未引入该特异序列的质粒比较酶切效率是否提高。
:
证实铜绿假单胞菌MutL具有剪切双链DNA的功能,鉴定MutL剪切双链DNA的关键
位点,寻找铜绿假单胞菌MutL发挥双链DNA剪切功能时是否依赖某一特异序列,初步揭
示MutL介导DNA大片段丢失的机制。
(1)证实铜绿假单胞菌MutL是介导细菌大片段DNA丢失的关键酶。
(2)验证铜绿假单胞菌MutL的双链DNA剪切功能。
(3)鉴定铜绿假单胞菌MutL是否具有特异识别位点或结构域。
:.
(3)拟采取的研究方案及可行性分析。(包括有关方法、技术路
线、实验手段、关键技术等说明)
(1)铜绿假单胞菌错配修复酶MutL编码基因的敲除实验及验证
由于转座子突变株是由转座子序列插入导致的基因插入失活,常规需要对转座子筛选到
的基因进行全基因敲除和回补实验,予以验证。
1)根据mutL的上下游同源序列,设计引物扩增约500bp的左、右同源臂(LA和RA),同
时设计引物扩增庆大霉素抗性基因(Gm),然后通过overlapPCR以三个片段为模板扩增出
一个完整的片段LA-Gm-RA,左右引物两侧引入BamHI/PstI双酶切位点,双酶切后连入基
因敲除载体pEX18Tc。
2)将基因敲除质粒经电击转化至铜绿假单胞菌PAO1中。
3)通过PCR和测序验证敲除株mutL基因的完全缺失。
4)噬菌体耐受菌筛选和观察:将10µl对数期的细菌PAO1ΔmutL(~106cell)与100µl噬
菌体JG004(~108pfu)混合后,直接全部涂布在LB平板上,让菌落分散均匀。观察至少1000
个噬菌体耐受菌菌落,观察有无红色菌落形成。重复三次。
(2)铜绿假单胞菌错配修复酶MutL的回补实验及验证:.
1)PCR扩增mutL基因:根据mutL基因及其启动子序列设计引物进行PCR扩增,引物两
侧分别引入BamHI/PstI酶切位点。
2)将PCR扩增产物进行BamHI/PstI双酶切后,连接入同样双酶切的大肠杆菌-绿脓杆菌
穿梭表达质粒pUCP24,转化大肠杆菌并鉴定。
3)将表达质粒经电击转化至铜绿假单胞菌PAO1ΔmutL中。
4)噬菌体耐受菌筛选和观察:将10µl对数期的细菌PAO1ΔmutL::mutL(~106cell)与100µl
噬菌体JG004(~108pfu)混合后,直接全部涂布在LB平板上。根据突变菌产生的概率,涂
布于LB平板,让菌落分散均匀。观察至少1000个噬菌体耐受菌菌落,观察有无红色菌落
形成。重复三次。
(3)铜绿假单胞菌MutL的表达与纯化
铜绿假单胞菌PAO1的mutL基因长度为1902bp,。为获得具有较高
活性的目的蛋白,我们选择pET表达质粒,以实现目的蛋白的高效表达。采用His标签和
Ni-NTA柱亲和层析的方法进行纯化。本实验拟选用pET28a质粒为表达载体,大肠杆菌BL21
为表达宿主菌。
1)PCR扩增mutL基因:根据mutL基因序列设计引物进行PCR扩增,在两条引物上分别
设计PstI和BamHI酶切位点。然后以PAO1的基因组DNA为模板,通过PCR扩增出
mutL基因,并将PCR产物进行胶回收,再用PstI和BamHI双酶切后,将酶切产物胶
回收置-20℃保存备用。
2)MutL的表达:用PstI和BamHI双酶切的表达质粒pET28a,与同样双酶切的mutL片
段进行连接,构建重组质粒pET-mutL。将pET-mutL转化入大肠埃希菌BL21感受态细
胞中,构建含有重组质粒的工程菌BL21-mutL。IPTG诱导菌株表达MutL蛋白,
SDS-PAGE电泳检测其表达情况。
3)MutL的纯化:先摸索MutL的最佳表达条件,然后进行大规模诱导表达培养,离心后
取沉淀进行超声破菌处理,,得到澄清的破菌上清。拟采用
Qiagen公司的Ni-NTA纯化系统纯化His融合蛋白,参照操作说明书进行,最后将样品
作SDS-PAGE电泳分析。
(4)铜绿假单胞菌MutL双链DNA剪切功能验证
根据已报道的MutL的功能研究,体外验证其核酸酶功能时,不需要MutS参与。因:.
此,本课题也将采用体外实验对MutL的双链DNA剪切功能进行验证。
1)纯化后的MutL与超螺旋质粒pBKS共孵育,参考mutL的体外剪切实验条件(20mM
Tris/HCl(),50mMNaCl,5mMMgCl,总体积30µl),37℃孵育1小时。加入6×
2
loadingbuffer(100mMEDTA,%SDS,70%•glycerol)终止剪切反应。每次试验至少
做三次重复。根据剪切作用,DNA图谱上可能会有三种条带。超螺旋supercoiled(SC)
质粒的条带,如果被MutL进行单链DNA切割会形成nicked(N)结构,如果被切断双链
DNA,那么会形成线性linear(L)DNA。因此,可以通过电泳进行区分,识别MutL是
否具有双链DNA剪切功能。
2)调整剪切条件:在剪切体系中,调整各种金属离子(MgCl、MnCl、ZnCl、NaCl)、
222
离子组合(如MgCl+MnCl、MnCl+ZnCll)、浓度及ATP后,进行酶切,比较酶切效
2222
果。
(5)铜绿假单胞菌MutL双链DNA剪切功能的关键位点验证
具有核酸酶功能的MutL普遍具有非常保守的功能结构域D(Q/M)HA(X)2E(X)4E,我们
将对PAO1的MutL的结构域通过PCR引入定点突变,分别构建D467A、H469A、E473A
和E478A等4个点突变的MutL表达质粒,观察这些位点是否是DNA单链和双链剪切的关
键位点。
1)定点突变:分别设计一对包含突变位点的引物,以重组质粒pET-mutL为模版,用Pfu
聚合酶进行循环延伸,正反向引物的延伸产物退火后配对成为带点突变的质粒。然后用
DpnI酶切PCR产物,由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌,已经被大肠杆菌的dam
进行***化修饰的,因此可被DpnI切碎,而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲
基化而不被切开,因此,转化大肠杆菌BL21后,即可得到点突变质粒的克隆。对于得
到的克隆进行测序验证。
2)将构建好的4个突变质粒分别进行表达。方法同(3)。
3)MutL突变体与超螺旋质粒pBKS共孵育,方法同(4),电泳观察有无线性化质粒条带。
(6)大片段DNA断裂位点的结构特点及分析
在“断臂求生”现象中,我们仅通过高通量测序完成了1株红色耐受菌的测序和断裂位
点鉴定工作,对其余红色耐受菌只进行了脉冲场电泳试验,发现不同红色耐受菌丢失的大片:.
段差异显著,在200~300KB之间。但是,多株细菌的断裂位点序列信息将有助于我们判断
断裂位点是否是完全随机事件,还是有一定的序列特异性。如大肠杆菌的错配修复系统依赖
GATC序列,而CRISPR/cas系统也依赖长度仅为几个碱基的PAM序列对目标进行识别。因
此,为了寻找断裂位点是否具有序列特异性,我们拟对10株不同的红色耐受菌的断裂位点
进行鉴定。
1)将PAO1三线法接种在LB平板后,37℃培养过夜。次日,分别挑取10个单克隆菌落,
接种到LB培养基中。此时接种的10个菌落均为独立的生物学重复。然后分别培养至对数
期,加入噬菌体JG004,培养5h后,将裂解液用三线法接种于LB平板。次日,分别从每
个平板收集一个红色耐受菌。保存后,对其断裂位点进行鉴定。已收集10个红色耐受菌,
将委托Novogene(诺禾致源)公司进行全基因组测序,从而鉴定断裂位点。
2)根据高通量测序结果,再在断裂位点两侧设计引物,通过PCR扩增和sanger测序,验证
断裂位点的正确性。
3)针对断裂位点及其前后2kb的序列进行BLAST分析,查找同源序列。
4)针对断裂位点及其前后2kb的序列进行NEBcutter分析,查找内切酶识别位点。
5)针对断裂位点及其前后2kb的序列进行MemeMotif在线分析,查找断裂位点附近序列
是否具有一定的结构域(Motif)。
6)如过发现有序列特异性,则在该序列两侧设计引物,以PAO1基因组为模板进行PCR扩
增,然后将含有该序列的PCR产物连接入pBKS质粒中。再重复(4)的步骤,进行MutL
体外酶切实验,比较双链DNA的酶切效率是否有差异。
(1)理论上可行。“断臂求生”现象中,细菌大片段DNA丢失具有三个显著的特点:大
片段(200~300kb)、高概率(~10-6)、非特异性。这种丢失现象不符合同源重组和随
机丢失介导的DNA丢失的特点。进一步的转座子突变文库筛选发现:mutL的转座子
插入突变株不能产生红色耐受菌。这强烈提示MutL可能就是介导DNA大片段丢失的
关键酶。
(2)技术方法上可行。本项目所涉及的主要实验方法均为常规的分子生物学技术手段,如
基因敲除、质粒构建、蛋白表达与纯化,技术方法非常成熟。高通量测序技术目前发
展迅猛,成本不断下降,因此细菌全基因组测序并鉴定断裂位点的工作将委托
Novogene公司完成。:.
(3)实验条件上可行。申请者所在的实验室长期从事细菌-噬菌体相互作用及细菌遗传学的
研究,课题组成员都受过细菌和噬菌体遗传学和生物化学技术的系统培训,梯队配备合理,
有充分的技术力量保证课题研究的顺利进行。此外,本实验室具备该项目研究所需的所有试
剂、仪器与技术等条件。我们已经从UniversityofWashingtonGenomeCenter购买了铜绿