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专利名称:含有高含量半胱氨酸食物原料的制造方法
本发明涉及一种制造含有高含量半胱氨酸的食物原料的方法,其特征在于,从含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母细胞中制备酵母提取物,通过控制温度在低至不高于60℃下浓缩提取物来制备固体浓度不少于10%的液体形式的食物原料,并将所得的食物原料保持在70至130℃。
[专利文献1]国际公开WO00/30474[专利文献2][专利文献3][专利文献4]国际公开号WO01/90310半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸用于改善食物味道。在JP-A-10-136883中,公开了一种将食物浸在含有半胱氨酸和胱氨酸的电解质中以抑制食物颜色变成褐色的方法。根据该发明,公开了在还原电极中胱氨酸被还原成半胱氨酸,以及用半胱氨酸抑制通过由酶氧化作用产生的奎宁所产生的褐色染料。因此,像这样使用胱氨酸以抑制食物变色,通过还原作用生产半胱氨酸的烦杂操作是必须的。在日本专利号3246064中,公开了利用半胱氨酸制造鱼干的技术。根据该发明,有这样的描述,在从原料鱼制成鱼干过程中添加了含硫化合物制成的鱼干中,味道得到提高,味道变质被抑制,并且在半胱氨酸中单位重量的效力高于在胱氨酸中。在国际公开WO93/08274中,公开了通过还原动植物蛋白中含有的氧化型胱氨酸残基制备的半胱氨酸残基用于改善制面包生面团的技术。同样地,半胱氨酸相对于其氧化型的胱氨酸具有广泛的使用范围和较高的效力。
关于制造具有如此广泛应用的半胱氨酸的方法,通过分解蛋白质的方法、半合成方法等都是已知的,目前主要使用的方法是通过分解蛋白质的方法和半合成方法。然而,在使用半胱氨酸用于上述目的的情况下,强烈需要含有高含量半胱氨酸的食物原料,但是到目前为止几乎还未发现含有高含量半胱氨酸的食物原料。
最近,根据国际公开WO00/30474(专利文献1)而清楚可知当含有γ-谷氨酰半胱氨酸(以下可被缩写成γ-GC)的食物原料在特定条件下进行酶处理或热处理时,产生了含有高含量半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸的食物原料。然而,在专利文献1中,虽然提到了源自γ-GC的半胱氨酸(在下文,可被称为Cys)和其氧化型的二硫化物胱氨酸的总生产率,但没有给出源自γ-GC的单独半胱氨酸的生产率。正如已经提到的,已经知道半胱氨酸相对于胱氨酸具有更广泛的应用和更高的效力,而且以效率高的方式生产半胱氨酸的方法在工业中是有用的。对于通过酶处理制造半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸来说,酶是必需的,并且这样的制造成本高于通过热处理制造半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸。
在这样的情况下,强烈需要一种通过热处理从γ-GC高效地制造半胱氨酸的改进方法。
除上面的专利文献1外,γ-(专利文献2)、(专利文献3)等等中公开了。专利文献2公开了如果将糖类加入γ-GC之中,并随后进行加热,就制备得到一种具有良好风味并且像烤肉味的风味组合物,专利文献3公开了将糖类加入含有一定含量的含硫化合物如谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物之中,并随后在没有脂肪存在的情况下进行加热,就制备得到一种具有烤肉风味的调味剂。然而,即使在那些专利文献2和3中,也没有公开从γ-GC高效率地制备半胱氨酸的这一发现。
在上面提到的关于现有技术的情况下,本发明的目的是提供从γ-GC高效率地生产半胱氨酸的方法,而且提供从酵母提取物制造含有高含量半胱氨酸食物原料的极好的方法。
顺便提一下,专利文献1公开了当γ-GC被加热时,正如已经提到的,以高产量获得了总量半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸。
现在本发明的发明人通过实验已经证实加热γ-GC的反应是作为一种分子内反应(参见将在后面提到的实验实施例1)进行。因此,通过热分解从γ-GC释放的半胱氨酸和其氧化型的二硫化物的产量不依赖于γ-GC的浓度,而且因此没有必要浓缩含有
γ-GC的水溶液。另一方面,在酵母提取物中含有的含硫化合物是丰富的,并且与γ-GC相互作用(参见将在后面提到的实验实施例2)。因此,当γ-GC在食物原料如含有含硫化合物的酵母提取物的溶液中进行热分解时,推测发生了以两个或更多分子反应为特征的分子间反应。因此,γ-GC在食物原料如酵母提取物的溶液中进行热分解的过程,显示出分子内反应和分子间反应竞争的反应机制。当分子内反应和分子间反应照此竞争时,分子间反应能够通过降低反应溶液中反应物的浓度而被抑制。另一方面,分子内反应本身不依赖底物的浓度,并且,即使反应溶液中反应物的浓度被降低,也并不会因而影响反应速度。因此,当反应溶液中反应物的浓度被降低时,分子间反应被抑制,结果分子内反应的效率相对增加。
肽的环化反应可以被列出来作为分子间反应和分子内反应照此竞争反应的例子。当合成环肽时,优先进行分子内环化(分子内反应),因此,通过高度稀释或通过将反应物溶液滴入溶液,从而降低反应溶液中反应物的浓度来进行反应,并且高产量合成环肽。
在这样的理论背景下,在食物原料如酵母提取物的溶液中所进行的γ-GC热分解中,在食物原料溶液为低固体浓度的条件下所进行的反应有助于提高源自γ-GC的半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸的生产率。在专利文献1中,描述了如果在溶解含有
%γ-GC的酵母提取物粉末之后,使产生的水溶液中固体浓度为2%再进行热分解,就获得了含有半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸总量2%的酵母提取物粉末(参见该文献的实施例1)。在当时源自γ-GC的半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸的生产率不少于90%,显示出正如上述提到的理论一样的非常高的生产率。
与胱氨酸相比,半胱氨酸,如已经提到的,具有广泛的应用并且在应用中具有高效用,因此,有必要证实在那篇文献提到的条件下半胱氨酸的生产率(向半胱氨酸的转化率)。因此,本发明的发明人依照那篇文献的实施例1,将含有γ-GC的酵母提取物粉末制成含有2%固体浓度的水溶液,在相同条件下进行热处理,并测定向半胱氨酸的转化率(即,在热处理后的水溶液中半胱氨酸的摩尔数除以在热处理前水溶液中γ-GC的摩尔数所得的商),因此从γ-GC到半胱氨酸的转化率约为40%。
为提高γ-GC到半胱氨酸的转化率,本发明的发明人已经进行了深入细致的研究,结果,他们已经发现当含有γ-GC的酵母提取物在浓缩的同时控制不高于60℃的低温,以产生含有不少于10%固体的浓缩物,然后通过保持温度高于上面提到的浓缩温度,在70至130℃下进行热处理,%的水溶状态中,,从γ-GC到半胱氨酸的转化率能够被提高到
70%,在这样发现的基础上,完成了本发明。这样的结果是预料不到的结果,不同于在γ-GC水溶液中由分子内反应和分子间反应竞争的分解反应中推测的结果。
因此,本发明涉及从含有γ-GC的酵母提取物中高效率地制造含有高含量半胱氨酸食物原料的方法,其包括这样的步骤经处理酵母细胞制备的酵母提取物在控制到不高于60℃的低温下浓缩,产生固体浓度不少于10%的浓缩物,然后将浓缩物保持高于上述浓缩温度,保持在70至130℃(热处理),优选70至100℃,或更优选75至100℃,优选在酸性条件下,,优选还原糖为低含量或,特别优选不超过1%,%的还原糖。
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图1A]这显示γ-GC的分解反应(浓度10mM)(实验实施例1)。
这显示γ-GC的分解反应(生产Cys)(浓度10mM)(实验实施例1)。
这显示γ-GC的分解反应(浓度100mM)(实验实施例1)。
这显示γ-GC的分解反应(生产Cys)(浓度100mM)(实验实施例1)。
这显示γ-GC与氧化型含硫化合物相互作用的机制(实验实施例2)。
这显示在GSSG共存和不存在的情况下Cys、γ-GC和GSH的加热反应(实验实施例2)。
这显示存在糖时γ-GC的分解反应(Cys的转化率)(实验实施例5)。
这显示溶解氧的浓度和γ-GC残留率之间的关系(实验实施例6)。
这显示γ-GC在DM中为3%时的分解反应(实验实施例7)。
这显示γ-GC在DM中为5%时的分解反应(实验实施例7)。
这显示γ-GC在DM中为8%时的分解反应(实验实施例7)。
这显示γ-GC在DM中为10%时的分解反应(实验实施例7)。
这显示γ-GC在DM中为20%时的分解反应(实验实施例7)。
这显示γ-GC在DM中为30%时的分解反应(实验实施例7)。
现在将详细阐明本发明如下。
(1)首先,含有γ-GC的酵母可按如下获得。
只要它是含有γ-GC的酵母,对于本发明中使用的酵母没有特别限制。由于为了使原料含有高含量的Cys,从含有少于1%重量γ-GC的酵母中制备的食物原料闻起来有酵母气味,因此优选使用含有不少于1%重量γ-GC(每单位干细胞重量含有的γ-GC重量)的酵母。由于γ-GC定位在酵母细胞的可溶部分,并且酵母细胞的近1/3重量为可溶部分,因此酵母含有的γ-GC的最大重量(每单位干细胞重量含有的γ-GC重量)不可能多于30%。这样酵母的例子是在国际公开WO00/30474(已经提到的专利文献1)中提到的H4ΔGSH2菌株和在国际公开01/90310(已经提到的专利文献4)中提到的
Nα2菌株和Nα3菌株。正如将在后面会提到的,在分解反应中γ-GC与酵母提取物中的具有SH基团的化合物相互作用,由此半胱氨酸的生产率降低,因此,优选使用细胞中谷胱甘肽含量低的酵母,%、%或更优选使用由于细胞生长平衡而仅含有少量谷胱甘肽的菌株。这样菌株的例子是具有谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母,其在387位的甘氨酸残基突变为天冬氨酸残基;具有谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母,其在54位的脯氨酸残基突变为亮氨酸残基;和具有谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母,其在370位有精氨酸残基和在其后缺失。
正如已提到的,只要它是含有γ-GC的酵母菌株,对于酵母菌株就没有特别限制,具体的例子是属于酵母属如酿酒酵母,裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母和假丝酵母属如产朊假丝酵母的酵母菌株。顺便提一下,在后面将要提到的实施例1中使用了利用在国际公开WO01/90310(已提到的专利文献4)中提到的方法所制备的二倍体酵母(酿酒酵母)N3菌株,其中谷胱甘肽合成酶的活性被削弱。
(2)接着将阐明从上述制备的酵母中制造酵母提取物的方法。
通过在优选的条件下培养种子酵母,上述制备的酵母的培养产物包含含有预测γ-GC量的酵母细胞。虽然有可能直接从培养产物中制造酵母提取物,当然酵母提取物也能够从曾经被从酵母培养产物中分离的含有
γ-GC的酵母细胞制造。只要使用的条件不明显分解γ-GC或Cys,制造酵母提取物的方法就没有特别限制,可仅仅使用一般方法。一个例子是酵母细胞被保留在60至80℃的热水中,使得内容物被提取,提取后的残渣(细胞残渣)被除去。像这样用热水提取方法制造酵母提取物时,酵母提取物中固体浓度通常约为百分之几。用热水提取方法制造酵母提取物时,细胞残渣被除去,因此酵母提取物中含有的每单位固体中γ-GC的含量增加到几倍的程度。例如,用热水从含有1%重量γ-GC的酵母细胞中提取内容物时,酵母提取物中含有的每单位固体中γ-GC的含量增加到约4-8%重量。顺便提一下,虽然该提取的效率较低,但是在提取温度保持在不高于60℃时从酵母细胞或培养的酵母中制造酵母提取物的方法,也不被排除在本发明的实施方案之外。那样的话,它就直接继续下一步的浓缩步骤,因此,温度持续地保持在不高于60℃,直到作为提取物的酵母提取物中的固体浓度达到10%或更多。
(3)根据本发明的方法浓缩上面制备的酵母提取物的方法如下。
因此,由于如上面所述方法制造的酵母提取物的固体浓度通常低至百分之几,有必要在使γ-GC转化为Cys的热处理之前浓缩。虽然优选低温浓缩,但只要γ-GC和Cys不明显分解,浓缩的方法就没有特别限制。在高温条件下的浓缩是不优选的,因为
γ-GC和Cys与酵母提取物中的含硫化合物相互作用,由此Cys的产量降低。
因此,在本发明中,酵母提取物在控制不高于60℃的低温下浓缩以制备固体浓度不少于10%的液体形式的食物原料。在低温下浓缩方法的具体例子是真空浓缩和冰冻浓缩。优选浓缩在几乎不含共存溶解氧下进行,例如不超过3ppm、优选不超过2ppm或更优选不超过1ppm。在溶解氧共存下浓缩是不优选的,因为Cys和γ-GC的SH基团被氧化,由此Cys的产量降低。按照在这样条件下进行的低温浓缩,在例如6到15小时内,酵母提取物中的固体浓度变为不少于10%。那样的话,例如也有可能酵母提取物成为固体,但是当成为固体时,在浓缩后,在随后的加热反应中,有必要用水或类似物将固体恢复成液体。因此,考虑到过程控制,优选在浓缩后酵母提取物为液体形式。
(4)接着将阐述如上面方法制备的液体形式的食物原料经受热处理以产生含有高含量半胱氨酸食物原料的方法。
浓缩后的酵母提取物的加热反应(热分解)优选在固体浓度不少于10%的液体形式的食物原料(水溶液)中进行。当热分解在固体浓度少于10%的水溶液中进行时,γ-GC的分解反应不会遵循一级反应进行,会发生不同于分解反应生成Cys的副反应,并且Cys的生产率降低,因此不是优选的。考虑到高效率地生产Cys,优选加热温度在70至130℃之间。当加