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含Fc融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法
本发明公开了一种含Fc融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法,步骤如下:制备Fc基因片段;将所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中,得连接产物pMD18T-Fc;将所得的pMD18T-Fc和表达载体pPICZαA经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切,并利用T4DNA连接酶连接,得含Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZαA-Fc。本发明将非Ig蛋白与抗体分子的Fc段融合,可改善其药物动力学特性,并使某些生物学活性与抗体的生物学效应功能联结在一起;该载体可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中高效表达含Fc端的融合蛋白。
【专利说明】含Fe融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酵母表达载体及其构建方法,特别涉及一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法。
【背景技术】
[0002]抗体的Fe端负责抗体的效应功能,如激活补体、结合Fe受体、穿越胎盘等。Fe融合蛋白主要是将生物活性蛋白与IgG的绞链区及CH2、CH3区结合。含Fe段的抗体融合蛋白将某些蛋白质与抗体Fe段融合主要是为了产生两种效果:一是增加该蛋白质分子在血液中的半衰期;二是通过该蛋白分子与其
配体的相互作用将Fe段的生物学效应引导到特定目标。
[0003]目前常用的表达载体中未含有Fe端融合蛋白的基因,在表达该类蛋白时需要自己构建,现有技术方案制备Fe融合蛋白是将生物活性蛋白的基因与Fe段基因通过重叠PCR连接好后,再构建到表达载体中,比较费时,费力。
【发明内容】
[0004]基于此,针对现有技术表达载体中未含有Fe端融合蛋白的基因,构建含有Fe的表达载体时,费时费力的问题,本发明提供含Fe融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法。
[0005]解决上述技术问题的具体技术方案如下:
[0006]一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体的构建方法,包括如下步骤:
[0007](I)制备Fe基因片段,;
[0008](2)将步骤(1)所得的Fe基因片段连接到pMD18-T载体中,得连接产物pMD18T-Fc;
[0009](3)构建表达载体:将步骤(2)所得的连接产物pMD18T_Fc和表达载体pPICZaA经EcoR1、NotI双酶切,并利用T4DNA连接酶连接,得含Fe融合蛋白的酵母表达载体pPICZaA-Fc。
[0010]在其中一些实施例中,步骤(1)所述制备Fe基因片段的制备方法为
:以人IgGl的重链恒定区为模板,用引物扩增,得Fe基因片段。
[0011]在其中一些实施例中,所述的引物为:
[0012]上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT,
[0013]下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0014]在其中一些实施例中,步骤(2)所述的连接为:于21_23°-。
[0015]根据上述构建方法制得一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体。
[0016]本发明一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法具有以下优点和有益效果:
[0017]本发明的构建方法,可快速、高效地表达含Fe端的融合蛋白;利用该方法得到的含Fe端融合蛋白的酵母表达载体,是将非Ig蛋白与抗体分子的Fe段融合,即直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体,所得到的酵母表达载体,可显著改善的非Ig蛋白药物动力学特性,并使某些生物学活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为人IgGlFc基因PCR扩增结果示意图;
[0019]图2为所制备的载体pPICZaA-Fc构建示意图;
[0020]图3为pPICZaA-Fc琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例
[0021]本发明通过将IgG1的绞链区及CH2、CH3区即Fe段,构建到酵母表达pPICZaA中,获得一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体及其构建方法,该构建方法可快速、高效的表达含Fe端的融合蛋白。
[0022]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例结合附图详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂或者试剂盒,均为市售产品。
[0023]其中,质粒H:暨南大学邓宁教授惠赠PMD18T-PLCH;
[0024]所用培养基的配方如下:
[0025]LB培养基:蛋白胨lg,,NaCllg,溶于IOOmL去离子水中,高压蒸气灭菌。
[0026]含Amp的LB琼脂平板培养基:蛋白胨lg,,NaCllg,,高压蒸气灭菌,灭菌完成后待温度降为50°C是加入Amp,使终浓度为
50μg/mL0
[0027]含Zeocin的LB固体平板培养基:蛋白胨lg,,NaCllg,,高压蒸气灭菌,灭菌完成后待温度降为50°C是加入Zeocin,使终浓度为25μg/mL。
[0028]以下将结合具体实施例进一步阐述本发明。
[0029]实施例1
[0030]一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体的构建方法,包括如下步骤:
[0031]1、制备Fe基因片段:
[0032]以人IgG1的重链恒定区为模板,用引物扩增,得Fe基因片段;
[0033]其中,所述的引物为:
[0034]
[0035]上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT,
[0036]
[0037]下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0038](PCR扩增结果参见图1,其中M为DNAMarker;I为Fe基因片段)
[0039]其中,Fe基因片段的序列为:[0040]
[0041]
【权利要求】
,其特征在于,包括如下步骤:(1)制备Fe基因片段,;(2)将步骤(1)所得的Fe基因片段连接到pMD18-T载体中,得连接产物pMD18T_Fc;(3)构建表达载体:将步骤(2)所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pPICZaA经EcoR1、NotI双酶切,并利用T4DNA连接酶连接,得含Fe融合蛋白的酵母表达载体pPICZaA-Fc0
,其特征在于,步骤(1)所述的制备Fe基因片段的制备方法为=WAIgG1的重链恒定区为模板,用引物扩增,得Fe基因片段。
,其特征在于,所述的引物为:
上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT,下游引物:GCGGCCGCTCAITTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
,其特征在于,步骤(2)所述的连接为:于21-23°-
-4任一项所述的构建方法制得一种含Fe融合蛋白的酵母表达载体。