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专利名称:司替铵研究用测定法的制作方法
技术领域:
本发明涉及用于测定的组合物、方法和试剂盒。更具体地讲,或标记用于测定中的用途。
背景技术:
用于检测同源核酸序列最常用的分子生物学技术之一是核酸杂交,即DNA/DNA、RNA/RNA或RNA/DNA杂交。在这项技术中,将用作探针的核酸(DNA或RNA)进行标记,然后使经过标记的核酸与待检测核酸(DNA或RNA)杂交。当用作探针的核酸与待检测核酸同源时,每条单链核酸与其互补序列杂交,以便形成双链序列,然后通过标记探针检测双链序列。
在许多医学分支学科中,独立地鉴定、标记、分离、修饰或者测定血液中或其它生物体液中的分析物、樣i生物、氨基酸或核酸序歹'J(例如多种病原体或多个基因或多个基因变异体)的需要日益明显。大多数多种分析物测定法(例如检测多个核酸序列的测定法),包括多个步骤,灵敏度差,动态范围有限(通常大约相差2-100倍)和/或常常要使用很复杂的仪器。在阐明人类基因组时,存在着进行实验的各种机会以确定特异序列的存在、区别纯合子和杂合子的等位基因、确定突变的存在、评价细胞表达图式等。在多数情况下,期望在一个反应内确定同一样品的多个不同特征。许多测定中,确定特异序列的存在,不论是
基因组序列、合成序列还是cDNA序列都是有益的。这些序列尤其与基因、调节序列、重复序列、多聚体区、表达图式等有关。确定一种或多种病原体的存在也同样有益。鉴定和定量测定可能分布于DNA里摩的大量碱基或序列的需要,向我们提出了严峻的挑战。理想的是,所用方法要精确,在限制所需试剂数量方面应适度经济和/或提供高度多重测定,允许鉴别和定量测定多个基因、和/或单核普酸多态性(SNP)测定、和/或RNA或蛋白质水平上的基因表达。
在早期药物开发测定中,放射性一直以来都是重要的读出信息。然而,对更多信息、更高通量和小型化的需要引起了向荧光检测方面的转变。基于荧光的试剂能够提供更有效的多参数测定,该测定的通量和信息量较高,而需要的试剂和试验化合物的体积较小。与基于放射性的方法相比,荧光方法既安全又便宜。
用于检测生物化合物的另一项技术是荧光原位杂交(FISH)(Swiger等(1996):245-254;Raap(1998):287-298;Nath等(1997):6-22)。FISH允许检测预定的靶寡核苷酸,例如通过用例如显孩i镜目测细胞或组织制备物中的DNA或RNA。因此,FISH在分子细胞遗传学、病理学和免疫学等领域,在临床及研究实验室中,都是重要的工具。
HSH包括荧光标记寡核苷酸探针以检测特异性互补DNA或RNA序列。准确地讲,FISH包括将寡核苦酸探针与含有或疑似含有耙寡核苷酸的细胞或组织制备物温育,该探针包含与至少一部分靶寡核苷酸互补的寡核苷酸。可检测标记(例如荧光染料分子)与寡核苷酸探针相结合。杂交位点所产生的荧光信号通常可用落射荧光显微镜观测到。另一个方法是用与抗原(例如生物素或洋地黄毒苷(digoxygenin))缀合
ii的寡核苷酸探针和针对该抗原的荧光标记抗体来显现探针与其DNA
靶的杂交。许多FISH形式为本领域所知。参见例如Dewald等(1993)
BoneMarrowTransplantation12:149-154;Ward等(1993).
Genet52:854-865;Jalal等(l998):132-137;Zahed
等(1992):483-493;Kitadai等(1995).
1:1095-1102;Neuhaus等(1999):81-86;Hack等主
编,(1980)AssociationofCytogeneticTechnologistsCytogenetics
LaboratoryManual.(AssociationofCytogeneticTechnologists,SanFrancisco,Calif.);Buno
等(1998)Blood92:2315-2321;Patterson等(1993)
Science260:976-979;Patterson等(1998)Cytometry31:265-274;Borzi
等(1996):167-176;Wachtel等(1998)Prenat.
:455-463;Bianchi(1998):175-185和Munne
(1998):863-870。
因此,用于鉴别和/或定量测定单基因或多基因、和/或SNP测定和/或RNA或蛋白质水平上的基因表达的测定法,因其具有灵敏度较高、动态范围大、荧光性较好、多重性程度较高和/或所用试剂较少和较稳定,所以可以提高多分析物测定的简易性和/或可靠性,并可以降低其成本。
在测定领域内还存在着对具有以下特征的标记物的持续需要(i)荧光强度高(用于小量检测),(ii)吸收频率与发射频率之间适当分开,(iii)溶解度良好,(iv)易与其它分子连接的能力,(v)对极端条件和高温的稳定性,(vi)用于多色去褶合的对称的、近似高斯发射线形(Gaussianemissionlineshape),和/或(vii)与自动化分析兼容。
附图简述
图1A至
图1L表示鼠乳腺癌4T1细胞与本发明某些实施方案的化合物一起温育(
图1B、
图1F和
图1J)以及与Hoechst共染色使细胞核染色(
图1A、
图1E和图II,蓝色)和与MitoTrackerDeepRed共染
12色使线粒体染色(
图1C、
图1G和
图1K,图像中出现绿色)的共焦成像。
图1D表示
图1A至
图1C所示图像的重叠图像。
图1H表示图IE至
图1G所示图像的重叠图像。
图1L表示图II至
图1K所示图像的重叠图像。
发明概述
本发明的实施方案包括用于确定疑似含有细胞、分析物、核酸或微生物的样品中细胞、分析物、核酸或微生物是否存在的测定法(assay),所述测定法包括将样品与标记试剂混合以形成标记细胞
、标记核酸或标记樣t生物,所述标记试剂包括直接使细胞、分析物、核酸或微生物染色以提供染色样品的染料,所述染色样品包括经染色的细胞、分析物、核酸或-隊生物,其中所述染料是下式I所表示的化合物
I
其中对于式I,NR,R2和服3114部分位于邻位、间位或对位;其中X-为阴离子盐;其中R2、113或114独立选自(^.10烷基(直链或支链)、烯烃(直链或支链),或者其中Ri和R2或者R3和R4与它们所连接的氮原子结合在一起构成吡咯烷-l-基环或哌啶-l-基环;其中R5为聚亚烷基二醇部分、C,,烷基(直链或支链)、烯烃(直链或支链)、炔烃、取代和未取代的芳基、取代和未取代的千基和/或有机金属部分。R5还可为有机金属化合物例如有机锡、有机硅或有机4者。此外,R5可为(CHA-MRs,其中n为l-6的数值,M为有机金属化合物例如有机锡、有机硅或有机锗,其中Rs选自丙基、丁基或任何烷基化合物;与染色样品接触;观察被染色细胞、分析物、核酸或4敬生物的累积。所述测定法可包括细胞测定法、化学测定法和生物学测定法。
13可将染料装入脂嚢泡或合适的生物材料中。具体地讲,可将染料装
入樣U交嚢、脂质体、胶束和/或双层胶束(bicelle)中,分别制成^t嚢化制品、脂质体制品、胶束制品和/或双层胶束制品。此外,染料可以
是加入聚乙二醇的(PEG化)。
本发明实施方案可包括含有配体或抗体和式I化合物的探针。所述探针可用来检测细胞、分析物、核酸和-微生物。
本发明实施方案还包括筛选与式I化合物结合的分析物的方法。本发明实施方案包括确定样品中一种或多种靶化合物是否存在,其中化合物用式I或荧光分子表示,步骤包括提供大量对一种或多种靶化合物特异性的电泳探针,每个电泳探针都具有靶结合部分;使样品与大量的电泳探针混合,致使在靶化合物存在下,各个輩巴化合物与其一种或多种特异性电泳探针形成复合物;分离和鉴定化合
物以确定一种或多种耙化合物是否存在。
本发明实施方案还包括用于合使细胞、分析物、核酸和/或^:生物染色的试剂盒。
发明详述
至于本文所述其它实施方案,我们将对本发明上述方面以及其它方面进行更详细的描述。应当理解的是,本发明可用不同形式予以体现,不应理解为是对本文所提出的实施方案的限制。更确切地讲,本文所提供的这些实施方案完整详尽,将向本领域技术人员充分表达本发明的范围。
本发明说明书所用术语仅用于描述具体实施方案的目的,并不是对本发明的限制。在本发明实施方案和所附权利要求书的描迷中,所用的单数形式同样包括复数形式,除非文中另有明确说明。同样,
本文所用"和/或"是指/包括一个或多个所列的相关项目的任何及所有可能的组合。本文所用术语例如"X和Y之间"和"约X和Y之间",应当解释为包括X和Y。本文所用术语例如"约X和Y之间"是指"约X和约Y之间"。本文所用术语例如"约X至Y,,是指"约X至约Y"。除非另有规定,否则所有术语,包括说明书中所用科技术语,都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
本文所引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全部结合到用于与提出引用的句子和/或段落有关的公开内容中。
"烷基",本文单独使用或者作为另一基团的组成部分使用时,是指含有1-10个碳原子的直链或支链烃基。烷基的代表性实例包括但不限于曱基、乙基、'正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-***己基、2,2-二曱基戊基、2,3-二***戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
本文所用"低级烷基"是一类烷基,是指含有1-4个碳原子的直链或支链烃基。低级烷基的代表性实例包括但不限于曱基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。
烷基和低级烷基可为未取代的或者被以下基团一次或多次取代卣素、烷基、卣代烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂环烷基、羟基、烷氧基、烯氧基、炔
氧基、卣代烷氧基、环烷氧基、环烷基烷氧基、芳氧基、芳基烷氧
基、杂环氧基、杂环烷氧基、巯基、烷基-S(0)m、卤代烷基-S(O)m、烯基-S(O)m、炔基-S(OV、环烷基-S(OL、环烷基烷基-S(O)m、芳基-S(0)m、芳基烷基-S(O、、杂环基-S(O)m、杂环基烷基-S(0)m、氨基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、自代烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、芳基氨基、芳基烷基氨基、杂环基氨基、杂环基烷基氨基、二取代氨基、酰氨基、酰氧基、酯、酰***、磺酰***、脲、
烷氧基酰氨基、氨基酰氧基、硝基或***基,其中111=0、l或2。
"烷氧基",本文单独使用或作为另一基团的组成部分使用时,是指如本文定义通过氧基连接到母体分子部分上的烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
"酰基"或"烷酰基",本文单独使用或作为另一基团的组成
部分使用时,是指-C(O)R基团,其中R为任何合适的取代基例如烷
基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基等。
本文所用"细胞"是指活的生物体或固定生物体的基本组分,包括细胞器。因此,检测细胞的存在、测定细胞、使细胞染色等可以指完整细胞或者细胞的至少一个细胞器。根据本发明的实施方案,