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·博士论坛·
基于Limma及功能富集探究复方金果胃康散
治疗胃癌的作用机制
宋健1孟凯强1杜娟2袁敏惠2白宇雪1常梦瑶1王捷虹2
杜晓泉2杨志宏2沈舒文1
【摘要】目的旨在通过广义线性模型的差异表达筛选及功能富集探究复方金果胃康散在胃癌的治疗作
用,为后续开展中药治疗癌症提供基础研究方向和临床的理论基础。方法从TARGET数据库下载胃癌患者临
床信息和测序RNA数据。通过中国知网等文献数据库及TCMSP对复方金果胃康散所有中药的有效成分及蛋白
进行收集整理,运用Excel、计算机R语言基本算法整理复方金果胃康散的蛋白质,将TARGET导出的胃癌患者样
本数据整理后进行聚类分析,再通过计算机R语言构建Limma和功能富集从而分析治疗作用。结果复方金果
胃康散7种药物包含有效成分1814种,蛋白358种。TARGET中共获得443个胃癌患者的样本,表达谱共获得
27226个基因,剔除了部分数据不全的样本,最后在407个样本中进行数据分析,将复方金果胃康散与胃癌患者取
交集共获得352个基因。根据单因素Cox分析产生的352个预后基因,采用一致聚类方法将胃癌患者分为C1和
C2两个亚组。175例患者被聚类为聚类1,232例患者被聚类为聚类2。
下,发现了98个上调基因,70个下调基因。KEGG结果显示复方金果胃康散基因主要在癌症通路富集,并且能富
集多种癌症通路,PPI分析确定了8个亚模型。GSEA显示DNA损伤反应对miRNA的调控、巨型BII淋巴细胞上
升、DNA损伤反应、肝癌、P75-NTR通路和ATM-信号通路等相关。结论复方金果胃康散作为沈舒文教授和
宋健副教授在胃癌治疗的临床常用方,从分子角度数据结果显示复方金果胃康散对胃癌有很好的治疗作用,同时
也阐明了在分子层面复方金果胃康散治疗作用的机制途径。
【关键词】复方金果胃康散;TARGET;Limma;功能富集;胃癌;GSEA
【中图分类号】【文献标识码】A
TherapeuticEffectofCompoundJinguoWeikangPowderonGastricCancer:Based
onLimmaandFunctionalEnrichment
SONGJian1,MENGKai-qiang1,DUJuan2,YUANMin-hui2,BAIYu-xue1,CHANGMeng-yao1,WANGJie-
hong2,DUXiao-quan2,YANGZhi-hong2,SHENShu-wen1
(,XianyangShaanxi712046;-
neseMedicine,XianyangShaanxi712000)
【Abstract】ObjectiveCompoundJinguoWeikangPowderisacommonclinicalprescriptionforgastriccancer,
,
-
sisofgeneexpressionmicroarraydata,especiallytheuseofgeneralizedlinearmodelfortheassessmentofdifferentialex-
pression,andfunctionalenrichmentanalysisisaconventionalbioinformaticsmethodtostudy“drugs-diseases”relation-
:ToexplorethetherapeuticeffectofCompoundJinguoWeikangPowderongastriccancerthroughdifferential
expressionanalysisbygeneralizedlinearmodelandfunctionalenrichment,andtoprovidebasicresearchdirectionandclin-
icaltheoreticalbasisforthefollow--

componentsandproteinsofActinidiaeChinensisRadixwereretrievedfromChinaNationalKnowledgeInfrastructure(CNKI)and
TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform(TCMSP)andtheproteinsofCompound
DOI:.
基金项目:全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教发[2016]42号);第六批全国老中医药
专家学术经验继承工作项目(国中医药人教发[2017]29号);陕西省大学生创新创业训练计划项目
(S202110716040);陕西省教育厅专项科学研究计划项目(18JK0225);陕西中医药大学科研计划项目
(2017PY09)
作者单位:,陕西咸阳712046;,陕西咸阳712000
通信作者:杜娟,Email:******@
·1284·世界中西医结合杂志2022年第17卷第7期WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine2022,,




-
,
patientswithgastriccancerwereclassifiedintoC1andC2byconsensusclusteringmethod,with175patientsinC1and232
,98up-regulatedgenesand70down--
getgenesofActinidiaeChinensisRadixweremainlyinvolvedintheKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)
-proteininteraction(PPI)analysisidentifiedeightsub-
showedthatDNAdamageresponsewasrelatedtomiRNAregulation,giantBIIlymphocyterise,DNAdamageresponse,liv-
ercancer,P75-NTR,,commonlyusedby
ProfessorShenShuwenandAssociateProfessorSongJianinthetreatmentofgastriccancer,showsidealtherapeuticeffect
,thisstudyalsoclarifiesthemechanismforthether-
apeuticeffectatthemolecularlevel.
【Keywords】CompoundJinguoWeikangPowder;TARGET;Limma;FunctionalEnrichment;GastricCancer;GSEA
胃癌是全球第五大常见癌症,并且其致死率排中的作用。
名第3,其危险因素包括年龄和性别等许多不可改
1资料与方法
变的变量[1]。此外,胃癌还有一些其他可控的风险
因素,例如感染幽门螺杆菌、吸烟以及高***
亚***盐的饮食等[2]。科研人员在关于“胃癌”的从TherapeuticallyApplicableResearchToGener-
基础性研究中发了一些相对稀有的危险致病因素,ateEffectiveTreatments(TARGET(-
包括既往胃部手术史、))数据库下载胃癌患者临床
史和恶性贫血。不仅如此,在对胃癌的研究中还发信息和测序RNA数据。
现,某些遗传性癌症综合征与之存在关联性。在遗通过中国知网等文献数据库及中药系统药理
传性弥漫性胃癌(Hereditarydiffusegastriccancer,学数据库与分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.
HDGC)综合征中发现了最强的关联,大约存在80%com/),Batman-TCM(http://bionet.
的HDGC患者会发展为胃癌[3]。其次还有Lynch、-tcm/),中药综合数据库(TC-
遗传性乳腺癌和卵巢癌(BRCA)、家族性腺瘤***MID)(/),对复方
肉病和Peutz-Jegher综合征[4]。金果胃康散中藤梨根、半枝莲、橘红、太子参、白花
复方金果胃康散是基于国家级名老中医沈舒蛇舌草、黄药子、守宫七味药的有效成分及蛋白进
文教授“瘀毒交阻”理论下,针对胃癌进展期的复行收集整理,按口服生物利用度(OB)≥30%、类药
方,由宋健副教授根据陕西中医药大学附属医院脾性(DL)≥,利用Uni-
胃病科院内制剂金果胃康胶囊加减化裁而来,该方prot数据库(/)及Gene-
由藤梨根、半枝莲、橘红、太子参、白花蛇舌草、黄药cards数据库(/)补全对
子、守宫七味药组成[5-7]。以“扶正攻邪、调畅气应成分所对应的蛋白。
机”为核心治疗思想,
显著的疗效,对胃癌患者的预后起到积极调控的①诊断为胃癌的样本;②具有绘制的临床信息
作用。和基因表达矩阵的样本;③具有完整临床信息的样
Limma(Linearmodelsformicroarraydata)是一本,至少包括存活时间、存活状态、年龄和性别;
种基于广义线性模型的差异表达筛选方法,在这里④如果有配对样本,则只包括一个。
我们使用R软件包Limma()
异分析,以获得不同比较组与对照组间的差异基①正常组织样本;②没有完整临床信息的样
因[8]。功能富集分析作为一种研究“药物-疾病”本;③在超过一半的基因中没有表达值的样品;
常规的生物信息学方法,主要通过对蛋白质形成的④表达值有偏差的样本。从目标数据库获得的443
功能集团在分子功能、细胞成分及通路层面的作用个样本被定义为训练队列。
进行探究[9]。
的分析方法探究复方金果胃康散在胃癌治疗进程将所有涉及的蛋白质名称以及基因名称进行标
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表1TARGET胃癌患者数据特征(例)
年龄性别生存状态组织学反应
类别
未成年(<18岁)成年(≥18岁)未记录女性的男性的活着的死亡的未记录第1/2阶段第3/4阶段未记录
队列(n=443)04385158285270168518922727
准化处理,运用国际专用缩写,如“Oxidativestress-心参与Limma和功能富集。
inducedgrowthinhibitor1”“BonemarrowstromalcellConsensusClusterPlus是一种具有置信度评估和
-derivedgrowthinhibitor”“BMSC-derivedgrowth项目跟踪的类发现工具,使用其进行聚类分析,使
inhibitor”“Ovary,kidneyandliverprotein38”用具有1-pearson相关距离的凝聚pam聚类,并对
“huOKL38”“Pregnancy-inducedgrowthinhibitor80%的样本进行10次重复采样[10]。利用经验累积
OKL38”“OSGIN1BDGIOKL38”统一规范为分布函数图确定最佳聚类数。根据单因素Cox分析
“OSGIN1”。产生的352个预后基因,采用一致聚类方法将胃癌
。根据CDF曲线线下面积评估,当K
运用Excel、计算机R语言基本算法整理复方值增大是CDF曲线线下面积逐渐增大,本研究需要
金果胃康散中的蛋白质,将TARGET导出的胃癌患尽量保持线下面积尽量大的前提下,根据CDFDelta
者样本数据整理进行聚类分析,再通过计算机R语下降趋势评估,尽量保持Delta下降最慢,综合以上两
言构建Limma和功能富集从而分析治疗作用。个因素折中选择聚类个数K=2。175例患者被聚类
为聚类1,232例患者被聚类为聚类2(如图1所示)。
2结果

()进行差异
复方金果胃康散有效成分1814种,蛋白358分析,以获得不同比较组与对照组间的差异基因。
种,其中藤梨根231种、半枝莲585种、橘红108种、获取的表达谱数据集,利用lmFit函数进行multiple
太子参124种、白花蛇舌草251种、黄药子356种、linearregression,进一步使用eBays函数进行com-
守宫159种。TARGET中共获得443个胃癌患者的putemoderatedt-statistics,moderatedF-statistic,
样本,胃癌患者样本的具体特征如表1所示。andlog-oddsofdifferentialexpressionbyempirical
本研究首先获取了表达谱,从GENCODE(ht-Bayesmoderationofthestandarderrorstowardsacom-
tps:///)中下载了vmonvalue,最终获得每个基因的差异显著性。将基
22版本的gff3(-因在胃癌患者样本中的表达特性分析结果如图2所
es/gencode/Gencode_human/release_22/,图2A火山图的绘图指标为:差异区间为
)文件和v33版本的gff3(ht-[-,],
tp://,,最小P值为1e
_human/release_33/.-16;图2B热图的绘图指标为:,显
gz)文件,从中提取了GeneSymbol和ENSG-,使用euclidean的距离计算方法,该热
mapping信息,将ENSG-ID映射到GeneSymbol上,图共展示了所包含基因的50个基因。聚类方法差
当存在多个匹配时,取中位数,最终获得了转换后异分析结果统计结果如表2所示。
的表达谱共获得27226个基因。
据不全的样本,最后在407个样本中进行数据分析,对于基因集功能富集分析本研究使用KEGG
将复方金果胃康散所含基因与胃癌患者取交集,共restAPI(.
获得352个基因,该352个基因将作为本研究的核html)获取了最新的KEGGPathway的基因注释,以
表2差异分析结果统计

显著性阈值比较组对照组
上调下调上调下调上调下调上调下调
P<
P<
C1C2
FDR<
FDR<
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注:A:聚类累计分布图;B:聚类累计曲线线下面积分布图;C:K=2聚类热图
图1聚类图
注:A:火山图;B:聚类热图
图2Limma组图
此作为背景,将基因映射到背景集合中,使用R软症通路,如图3A,3B。利用Metascape(https://
件包clusterProfiler()进行富集分析,)进行数据富集通路的可视化处理。
以获得基因集富集的结果,设定作图指标为最小基从Metascape数据库进行GO分析并可视化,对聚集
因集为5,最大基因集为5000,pvalue<,PPI分析确定了8
FDR<,绘制KEGG饼图和气泡图,气泡图展示个亚模型,均与胃癌和免疫密切相关,表明免疫可
前10种富集通路结果,KEGG结果显示复方金果胃能与复方金果胃康散对胃癌的贡献有关,如图3C,
康散基因主要在癌症通路富集,并且能富集多种癌3D。第1个亚模型与癌症中的通路、PID调节GR
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通路和肿瘤抑制素M信号通路相关;第2个亚模型合,用以评估相关途径和分子机制,基于基因表达谱
与脂质与动脉粥样硬化、免疫系统中的细胞因子信和表型分组。GSEA显示DNA损伤反应对miRNA的
号和白细胞介素信号相关;第3个亚模型与A/1类调控、巨型BII淋巴细胞上升、DNA损伤反应、肝癌、
(视紫红质样受体)、Galpha(i)信号事件和GPCRP75-NTR通路和ATM-信号通路等相关。进行基
配体结合相关;第4个亚模型与利什曼原虫感染、因组变异分析(GSVA)以证明两个集群之间的信号
ADORA2B介导的抗炎细胞因子产生和利什曼原虫通路改变。并且,利用同一数据集,进行基因集富集
生长和存活率相关;第5个亚模型与对激素的反应、分析(GSEA)来分析聚类之间的差异。见图4。
对细胞外刺激的反应和对活性氧物种的响应相关;
3讨论
第6个亚模型与Galpha(q)信号事件、钙信号通路
和A/1类(视紫红质样受体)相关;第7个亚模型与胃癌是继肺癌之后的第二大癌症死亡原因,平
突触后膜电位的调节、***化物运输和无机阴离子传均5年生存率不到20%[11]。由于晚期胃癌患者预
输相关;第8个亚模型与细胞凋亡和凋亡调节和信后较差,因此迫切需要制定新的策略来提高该疾病
号传导相关。的存活率[12]。中医药在胃癌的治疗中有着独特的
对于Genesetenrichmentanalysis(GSEA),本研优势,阐明中药在胃癌进展过程的作用,对进行后
究从GSEA([13-15]。
)网站获得了GSEA软件(),根本研究通过Limma进行了核心基因的数据分
据聚类将样本分成两组,并从MolecularSignatures析,对于聚类的C1和C2进行了在不同胃癌患者样
Database(--本中的分析,,发现了
),70个下调基因。从样本的基因热图
注:A:KEGG富集气泡图;B:基因-通路相关饼图;C:路径与过程富集分析;D:蛋白质相互作用富集分析
图3功能富集结果图
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图4GSEA结果图
可以看到,以糖原磷酸化酶(PYGM)、溶质载体家族可以直接阐明不同组中基因集的表达趋势[17]。在
2、促进葡萄糖转运蛋白成员4(SLC2A4)、K物质受这项研究中,GSEA显示DNA损伤反应对miRNA的
体(TACR2)、钙激活钾通道亚基alpha-1调控、巨型BII淋巴细胞上升、DNA损伤反应、肝癌、
(KCNMA1)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M2(CHRM2)、P75-NTR通路和ATM-信号通路等相关。进行基
cGMP特异性3′,5′-环状磷酸二酯酶(PDE5A)、雄因组变异分析(GSVA)以证明两个集群之间的信号
激素受体(二氢睾***受体)(AR)和孕激素受体通路改变。
(PGR)等在内的分子,在C1聚类的表达值远高于本研究存在一些缺陷,在归纳结论时应予以注
在C2聚类的表达值;相反受体酪氨酸蛋白激酶意。第一,由于缺乏关于胃癌患者进展的信息,如治
erbB-2(ERBB2)、NADPH-细胞色素P450还原酶疗进展情况,本研究无法证明复方金果胃康散在胃癌
(POR)、真核翻译起始因子6(EIF6)、Bcl-2样蛋发展中的具体作用。第二,本研究的结果来自于生物
白1(BCL2L1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、信息学分析,没有得到实验的进一步验证。第三,本
Claudin-4(CLDN4)和受体酪氨酸蛋白激酶erbB-研究中使用的胃癌患者样本数据是从开放数据库下
3(ERBB3)等在内的分子,在C2聚类中的表达值远载的,而不是我们的队列。低成本的回顾性研究的证
高于C1的表达值。据水平仍然存在,需要进行更多的前瞻性研究来进一
之后,本研究进行了C1和C2两个亚组之间的步证实复方金果胃康散在胃癌中的预后价值。
功能分析,以探索潜在的生物学机制。GO分析和总之,在本研究中,以开放数据库TARGET中
KEGG分析提示癌症通路、尿活性配体-受体相互所记录的胃癌患者数据为样本,该数据库有这强大
作用、人巨细胞病毒感染和钙信号通路可能胃癌发的数据集群,详细分析了每一个临床样本包括年
生和发展中的作用。同时在KEGG中发现在分子龄、性别、人种、居住地等不同的特征,同时也包含
聚集数量最多的前10条通路,不仅出现的癌症通了癌症组织及蛋白的数据,故为开展后续研究提供
路,还包含了前列腺癌和胰腺癌两种特征性癌症,了良好的基础。Limma及功能富集是本研究主要研
从而说明在分子功能角度来看,复方金果胃康散在究的两部分内容,在开展Limma及功能富集之前,
癌症治疗方面通过所包含的多种蛋白起到明确的将样本数据聚类为两种分子亚型(C1和C2),为后
治疗作用。然而,癌症通路、尿活性配体-受体相续差异性对比提供了基础。在开展Limma及功能
互作用、人巨细胞病毒感染和钙信号通路之间的详富集之后,做了GSVA和GSEA分析,以进一步阐明
细关系仍不清楚。因此,本研究进行了GSVA和潜在的机制。通过GSVA计算每个样品中信号通路
GSEA分析,以进一步阐明潜在的机制。通过GS-的活性并估计不同组之间的变化,通过GSEA阐明
VA,根据基因表达水平计算每个样品中信号通路的不同组中基因集的表达趋势。通过以上完整分析
活性,并且可以估计不同组之间的变化[16]。GSEA之后,从分子角度数据结果显示复方金果胃康散对
分析是一种整合基因表达信息的典型方法,通过它胃癌有较好的治疗作用,并阐明了在分子层面复方
世界中西医结合杂志2022年第17卷第7期WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine2022,,·1289·
金果胃康散治疗作用的机制途径。为后续开展复[10]WILKERSONMD,:aclassdis-
方金果胃康散的胃癌方面的研究提供理论基础。coverytoolwithconfidenceassessmentsanditemtracking[J].
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