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专利名称:口蹄疫病毒抗原多肽、融合抗原多肽及疫苗的制作方法
技术领域:
本发明涉及口蹄疫病毒抗原多肽,融合抗原多肽,以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗。本发明还涉及上述抗原多肽,融合抗原多肽和疫苗的制备及其应用。
背景技术:
口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄类动物,其临床诊断特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。成年动物感染口蹄疫后一般致死率不高但其发病率可达100%,发病动物的口、蹄部会出现大量水疱,精神沉郁,进而使得畜产量锐减。幼畜感染口蹄疫后则经常会不见症状地猝死,严重时致死率可达100%。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少,因此每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患,从而给畜牧产业造成巨大的经济损失。口蹄疫病毒是口蹄疫的致病原,其属于细小核糖核酸病毒,具有多血清型、高变异性等特点。已知口蹄疫病毒目前有0、A、C、SATl(南非I型)、SAT2(南非II型)、SAT3(南非III型)和Asial(亚洲I型)7个主要血清型。每种主型又分若干亚型,目前发现的亚型已有
70多种。口蹄疫病毒各型之间的抗原性常常不同,彼此之间不能交互免疫,而且在同一种血清型中抗原变异的程度也很大,以至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能对同一血清型中的另一种亚型却没有保护。因为口蹄疫病毒的高异变性和各血清型之间通常不能相互免疫,所以给口蹄疫的防治工作带来巨大的困难。目前仍迫切需要提供对口蹄疫病毒具有良好免疫原性的疫苗,理想的疫苗还应对多种不同亚型的口蹄疫病毒都具有良好的免疫原性,从而可以为牲畜提供广泛的免疫保护。
发明内容
本发明涉及口蹄疫病毒抗原多肽,融合抗原多肽,以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗,该抗原多肽,融合抗原多肽和疫苗可使宿主动物产生针对多种不同谱系口蹄疫病毒的免疫原性,从而为宿主动物提供针对多种不同谱系口蹄疫病毒的免疫保护。就本发明而言,术语“免疫”是指,以适宜的形式和通过适宜的途径对宿主动物给与某一抗原后,诱导宿主动物产生针对该抗原的特异性的细胞介导的和/或基于抗体的免疫应答,例如,抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的活化,和/或其它细胞应答反应。就本发明而言,术语“免疫原性”是指一种或多种抗原诱导宿主动物产生针对该一种或多种抗原的特异性的免疫反应的能力。就本发明而言,术语
“抗原多肽”是指由两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的具有免疫原性的肽链结构。本发明的肽链结构可以是直链的,带分支结构的,和/或带环状结构的。就本发明而言,术语“疫苗”是指含有一种或多种具有免疫原性的抗原并被配制成能向宿主动物给药形式的制剂。将疫苗引入到宿主动物体内后,该疫苗就能激发宿主动物产生针对该一种或多种抗原的免疫反应。就本发明而言,术语“宿主动物”是指能够被口蹄疫病毒侵入并允许口蹄疫病毒在其体内复制的动物。在某些实施方式中,宿主动物是偶蹄动物。在某些实施方式中,宿主动物是猪、牛、羊等家畜动物。口蹄疫病毒在宿主动物中的侵入和复制可能使宿主动物产生口蹄疫的临床特征,也可能不使宿主动物产生任何临床特征。本发明提供了一类人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。根据本发明的一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列CysLysTyrAlaGlyXlSerLeuX2AsnValArgGlyAspLeuX3X4LeuX5GlnLysAlaAlaArgX6LeuProThrSerPheAsnTyrX7AlalieLys(SEQIDNO:1),其中,Xl=Gly或Ala,X2=Thr,Leu或Pro,X3=Gln或Leu,X4=Val,Glu或Ala,X5=Ala或Asp,X6=Pro或Cys,X7=Gly或Cys,且X6和X7必须有一个且只能有一个取Cys。根据本发明的另一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列ValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyXlSerLeuX2Asn
ValArgGlyAspLeuX3X4LeuX5GlnLysAlaAlaArgX6LeuProThrSerPheAsnTyrX7AlalieLys(SEQIDNO:2),其中,Xl=Gly或Ala,X2=Thr,Leu或Pro,X3=Gln或Leu,X4=Val,Glu或Ala,X5=Ala或Asp,X6=Pro或Cys,X7=Gly或Cys,且X6和X7必须有一个且只能有一个取Cys。根据本发明的另一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列ValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyXlSerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuX2X3LeuX4GlnLysAlaAlaArgCysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(SEQIDNO:3),其中,Xl=Gly或Ala,X2=Gln或Leu,X3=Val,Glu或Ala,X4=Ala或Asp。根据本发明的另一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列CysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgCysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(SEQIDNO4)。根据本发明的另一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列ValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgCysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(SEQIDNO:5)。根据本发明的另一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列CysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrCysAlalieLys(SEQIDNO6)
。根据本发明的另一个方面,本发明提供的抗原多肽含有如下所示的氨基酸序列
ValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrCysAlalieLys(SEQIDNO:7)。本发明的抗原多肽包含上述氨基酸序列在一个或多个氨基酸位点进行一个或多个氨基酸的替换、添加和/或删除所产生的序列。氨基酸替换包括保守替换和非保守替换。保守替换是指性质相似的氨基酸之间的替换,例如极性氨基酸之间的替换(如谷氨酰***和天冬酰***之间的替换),疏水性氨基酸之间的替换(如亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸之间的替换),以及带相同电荷的氨基酸之间的替换(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的替换,或者谷氨酸和天冬氨酸之间的替换)等。非保守替换是指不同性质的氨基酸之间的替换,本发明所包含的非保守替换将不会改变所述抗原多肽针对口蹄疫病毒的特异性免疫原性和活性。本发明所述的氨基酸的替换、添加和/或删除将不超过1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个或10个氨基酸。根据本发明的另一个方面,本发明提供了一类包含两个或更多个本发明的抗原多肽的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的多个抗原多肽彼此之间共价或非共价连接。共价连接例如可以是通过酯键、醚键、磷酸酯键、酰***键、肽键、二酰亚***键、碳
-硫键,或者碳-磷键相互连接。非共价连接例如可以是通过离子间的相互作用力、疏水作用,或者氢键相互连接。在本发明的一个实施方式中,融合抗原多肽所含的多个抗原多肽通过连接链连接。就本发明而言,术语“连接链”是指,用于共价或非共价连接相邻的两个多肽序列的结构单元,该结构单元的引入不会对融合抗原多肽的免疫原性产生损害。连接链可包括一个或多个氨基酸残基,连接链还可以包括例如C1-C6烷基、C3-C6环烷基、芳基或杂芳基等结构。现有技术披露了一些已知的连接链,本领域技术人员可以根据需要容易地加以选择。在本发明的另一个实施方式中,融合抗原多肽中所用的连接链由一个或多个赖氨酸,丙氨酸,甘氨酸,丝氨酸和/或脯氨酸或其任意组合组成。例如连接链由1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个或更多个前述氨基酸或其任意组合组成。在本发明的另一个实施方式中,融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个赖氨酸组成的短肽,例如短肽序列LysLys,LysLysLys,LysLysLysLys,LysLysLysLysLys,LysLysLysLysLysLys0在本发明的另一个实施方式中,融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个赖氨酸和丙氨酸混合组成的短肽,例如LysAlaLys,AlaLysAla,LysAlaAlaLys,AlaLysLysAla,LysLysAlaLys,AlaLysAlaLys,LysLysAlaLysLys
或者LysAlaLysLysAlaLys。在本发明的另一个实施方式中,融合抗原多肽中所用的连接链为由一个或多个脯氨酸,和/或丝氨酸和/或甘氨酸混合组成的多肽,例如ftx)SerPro,SerProSer,SerSerPro,ProProSer,GlySerGly,SerGlySer,SerSerGlySer,GlyGlySerGly,GlySerGlySer,GlySerGlySerSer,GlyGlyGlyGlySer0融合抗原多肽所包含的抗原多肽数量例如可以是2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个或者更多个。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的。例如,,,。
融合抗原多肽包含的抗原多肽可以是天然的口蹄疫病毒抗原多肽序列,也可以是人工合成的口蹄疫病毒抗原多肽。在本发明的一个实施方式中,融合抗原多肽包含一个或多个本发明提供的抗原多肽序列和一个或多个天然抗原多肽序列。例如,融合抗原多肽包含一段本发明提供的抗原多肽序列和一段天然抗原多肽序列。又例如,融合抗原多肽包含至少一段本发明提供的抗原多肽序列和至少一段天然的抗原多肽序列。在本发明的另一个实施方式中,本发明的融合抗原多肽包含口蹄疫病毒表面壳蛋白
VPl的全部或部分氨基酸序列。已知的0型口蹄疫病毒的壳蛋白VPl的一种天然氨基酸序列含有213个氨基酸,其氨基酸序列如下ThrThrSerThrGlyGluSerAlaAspProValAlaProThrValGluSerTyrValGlyGlnThrGlnValGlnArgArgHisHisThrAspValSerPhelieLeuAspArgPheValLysValThrProLysAspSerlieAsnValLeuAspLeuMetGlnThrProProHisThrLeuValGlyAlaLeuLeuArgThrAlaThrTyrTyrPheAlaAspLeuGluValAlaValLysHisGluGlyAspLeuThrTrpValProAsnGlyAlaProGluAlaAlaLeuAspAsnThrThrAsnProThrAlaTyrHisLysAlaProLeuThrArgLeuAlaLeuProTyrThrAlaProHisArgValLeuAlaThrValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLysAlaThrArgValThrGluLeuLeuTyrArgMetLysArgAlaGluThrTyrCysProArgProLeuLeuAlaValHisProSerAlaAlaArgHisLysGlnLyslieValAlaProValLysGlnSerLeu()(SEQIDNO:8)。在本发明的另一个实施方式中,本发明的融合抗原多肽包含如下所示的一种或多种天然抗原多肽序列CysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(SEQIDN
O9);ValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(SEQIDNO:10)。在本发明的另一个方面,本发明提供了一类包含本发明的抗原多肽和T辅助细胞表位的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的抗原多肽和T辅助细胞表位可以分别是一个或多个,例如融合抗原多肽分别包含1个,2个,3个,4个,5个,6个,7个,8个,9个,10个或更多个抗原多肽和T辅助细胞表位。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的,所包含的T辅助细胞表位可以是相同的也可以是不相同的。相邻的抗原多肽和T辅助细胞表位之间、相邻的抗原多肽之间或者相邻的T辅助细胞表位之间可以通过其自身氨基酸形成的肽键连接,亦或通过本发明前述部分提到的其它任意方式相连接,例如通过连接链连接抗原多肽和T辅助细胞表位。此类融合抗原多肽的非限定性实例例如是lieSerlieGluSerlieGlyLysVallieValLysHislieGluGlyliePheLeuLeuLysValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgCysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(),和lieSerlieGluSerlieGlyLysVallieValLysHislieGluGlyliePheLeuLeuLysValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuThrAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrCysAlalieLys()