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卷枝毛霉菌株、其培养方法及其在c21、c19甾体和氮杂甾体生物转化中的应用的制作方法.docx

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卷枝毛霉菌株、其培养方法及其在c21、c19甾体和氮杂甾体生物转化中的应用的制作方法.docx

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卷枝毛霉菌株、其培养方法及其在c21、c19甾体和氮杂甾体生物转化中的应用的制作方法.docx

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专利名称:卷枝毛霉菌株、其培养方法及其在c21、c19甾体和氮杂甾体生物转化中的应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及微生物菌株、其培养方法及其在甾体生物转化上的应用,尤其涉及一株具有立体选择性羟化甾体底物的霉菌和优化后的转化培养基及利用该菌株对具有4-烯-3-***和5-烯-3-醇结构特征的C21和C19甾体底物转化为羟基化衍生物的方法。
背景技术:
甾体化合物又称类固醇化合物(steroid),是一类具有环戊烷骈多氢菲母核的有机化合物,广泛存在于生物体组织内,如甾醇,维生素D,胆汁酸,许多性激素,肾上腺皮质激素,某些致癌烃,甾族皂素以及甾族生物碱等均属此类。由于母核上取代基、双键位置或立体构型的不同,形成了一系列具有独特生理功能的化合物。如甾体激素是动物界所特有的一类甾体化合物,包括性激素和肾上腺皮质激素,是维持生命、保持正常生活、促进性器官发育、维持生殖的重要生物活性物质,不仅能治疗疾病,而且也是计划生育及调节免疫等方面不可缺少的药物。近年来甾体药物的应用领域不断扩大,如用于治疗淋巴白血病、细菌性脑炎、人体器官移植以及和内分泌有关的老年性疾病,另外具有甾体骨架的抗肿瘤、利尿、麻醉、肌松
等方面作用的新药也不断涌现,此外,甾体激素亦开拓应用于促进家畜繁殖生长及植物生长。随着甾体药物应用范围的不断扩大,甾体医药产业呈现出很好的发展态势,成为仅次于抗生素的第二大类药物。据统计,80年代初以来,世界甾体药物总产量及销售额以年14%-15%的速度增长,此增长率不低于抗生素、抗感染药物、心血管药物、中枢神经药物和解热镇痛药物。由于甾体药物的不可取代的作用及治疗适应症不断扩大,甾体药物越来越引起人们的重视。甾体微生物转化反应是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物,其在甾体药物生产中占有重要地位,常常被用于某些甾体激素类药物中间体的合成。与化学合成相比,甾体微生物转化反应具有立体专一性强,收率高,副产物少,反应条件温和及价格低廉等优点。羟化反应是甾体微生物转化中最重要的反应,如可的松、泼尼松、地塞米松、倍他米松等皮质激素药物的生产,将底物16a、17ci-环氧黄体***引入ll-ci羟基是其关键一步。微生物能在甾体的任何位置进行羟基化反应,包括两个角***和侧链,而化学方法除了较易在C17引入羟基外,在其他位置都很难引入。本发明筛选到一株对甾体化合物具有羟基化作用的霉菌,目前国内外均未见其用于甾体类物质转化的报道。经过对其进行培养条件优化,能够以较高的收率得到目标产物。该
菌株对4-烯-3-***类甾体底物的羟基化主要发生在6P位,7ci位和14a位,而对5-烯-3醇类甾体底物的羟基化则是发生在7ci位和lla位。ll位的羟基是皮质激素类药物抗炎的必需基团,具有7-羟基的甾体物质则主要表现出调节激素水平、增强免疫、抗皮质激素样作用等,因此利用生物转化法合成该类物质,对激素类药物或其中间体的生产具有非常重要的意义。在此基础上再对转化产物进行衍生物设计,还可以为开发具有上述作用的新药奠定良好的基础。发明内容本发明目的在于提供一株具有羟基化甾体底物的霉菌;另一目的在于提供该菌种的培养方法;又一目的在于将该菌种应用于具有4-烯-3-***或5-烯-3醇结构特征的C21和C19类甾体底物生物转化为其羟化产物方法中。为实现本发明目的,本发明技术方案如下本发明提供一株巻枝毛霉菌株(Mucorcircinelloideslusitanicus)AY234877,该菌株己于2007年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路),。该霉菌能产生具有立体选择性的羟化酶,其特征在于可在甾体底物的6e,7a,11a,14a等位置选择性地进行羟基化。该菌株形态特征菌落在PDA培养基上生长迅速,28。C时,20小时菌落半径达5080咖,菌丝层较厚,初期为白色,后期逐渐转为黄褐色至深褐色,菌落背面无色,不分泌
色素,菌落无味。镜下观察菌丝透明,有隔,无假根,分生孢子梗由菌丝直立生出,无色,分枝多,孢囊梗为单轴状分枝,分枝不规则,孢子囊球形,顶生,直径2070um,囊轴球形至卵圆形,长2060um,孢子褐色,球形或短椭圆形,6X105X8um。根据以上特征,初步鉴定为巻枝毛霉。该菌株生理生化特征菌丝的生长和孢子萌发与温度、湿度、pH值和培养基质有密切关系。菌株在2032"C均有不同程度的生长,28'C生长速度最快;菌株对环境pH值有较强的适应性,在pH值47的弱酸性条件下均能生长,;菌株在相对湿度为6080%时孢子萌发率较低,饱和湿度时萌发率最高,可见充足的水分是孢子萌发的必要条件;孢子在无营养的蒸馏水中不能萌发,必须有一定的有机物作为营养或刺激,不同营养物质对其孢子萌发也有影响,在营养成分复杂的有机物浸汁如马铃薯葡萄样培养基中萌发率最高,可达到95%以上,其次为酵母膏蛋白胨培养基,萌发率达到83%左右,而在成分比较简单的无机溶液如察氏培养基中的萌发率最低,只有不到50%,该菌株的筛选包括以下步骤(1)采集土样,以底物为唯一碳源进行富集培养,富集培养液适当稀释后涂布平板培养,将分离良好的菌落挑至斜面,得到能作用于底物的菌种。(2)将斜面菌种接种于液体培养基中培养一定时间后加入底物进行转化,提取产物后进行分离纯化,并对产物的结构进行鉴定,确定具有羟化能力的菌株。
(3)通过对菌落形态、菌体细胞形状和大小、有无孢子和菌丝形成以及繁殖方式的观察对菌种进行初步鉴定。(4)对筛选到的转化率高的菌种进行培养基优化,确定了发酵培养基组成为麦芽糖3065%>,优选50%。;蛋白胨1024%。,优选18%。;%。,%。;%。,%。;%。,%。;,;接种量110%,优选5%;装液量60120ml/500ml瓶,优选80ml/500ml瓶。(5)摇瓶培养条件为在温度2540°C,优选28"C,转速为150240rpm,优选220rpm条件下培养2472h,优选48h。最终对菌种进行16SDNA基因序列测定,表明其含有426个碱基对,经基因库检索证实该菌株的基因与巻枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)完全一致。确定其为巻枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)。本发明以有如下结构通式的甾体作底物,利用上述的巻枝毛霉进行生物转化制备羟基化甾体衍生物formulaseeoriginaldocumentpage6通式l通式2通式3(in/in-。F)--06in/in-。F之间。相比较,-06in/in-。-06in/in-。F之间。在示例性的实施例中,可以形成衬管12的材料包括,但不限于陶瓷、陶资基质复合物、及耐腐蚀金属。市场上可得到的耐腐蚀金属的例子包括,但不限于
Inconel625;Haynes188及HR-160,从印第安那州的科科莫(Kokomo,IN)的Haynes国际有限公司(HaynesInternational,Inc.)可得到。虽然已讨论的气化器10包括歧管20,气化器10可以可选择地没有歧管构成,或用不同配置的歧管构成,而不脱离本发明的意图范围。操作中,冷却剂流入歧管20,在那里其被引导进入衬管12的头端26。虽然在衬管12和喷射器18以及在衬管12和容器14的连接处可能有较小的冷却剂泄漏,但因为冷却剂会最终离开进入容器14中,泄漏是可接受的。当冷却剂穿过衬管12,冷却剂从反应腔24获得热量并冷却衬管12。因为衬管12的尾端28悬伸于容器14内,冷却剂最终倾倒进入容器14,紧接于激冷区段22的上游。适合的冷却剂的例子包括,但不限于蒸汽、氮、二氧化碳、及合成气体。适合的冷却剂的温度范围在大约100。F(38。C)与大约1200。F(649。C)之间。特别适合的冷却剂的温度范围在大约600下(316。C)与大约1000°F(760°C)之间。以某一速率流经衬管12的冷却剂足够沿衬管12的外表面36凝结熔渣层34。从流经反应腔24的富含碳的燃料内的灰分中形成的熔渣层34。气化器10在高温度中操作,灰变成熔渣。流经衬管12的冷却剂的温度足够低,以将衬管12保持在将溶渣层34凝结在外表面36上的温度。溶渣层34保护衬管12不被高速度微粒磨损,并不被在反应腔24内的气相活性物质化学侵蚀。或者,如果溶渣层
34没有沿衬管12的外表面36沉积,那么衬管12可以由硬化的或涂覆的棵金属形成,以抵抗磨损,并被冷却以达到能够经受住化学侵蚀的表面温度。冷却剂从衬管12离开的速度还提供在衬管12的尾端28处的熔渣实施例2:对筛选出的巻枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus),分别对碳源、氮源、金属离子、初始pH值、接种量、装液量等条件进行优化,确定了发酵培养基组成为麦芽糖50%。;蛋白胨18%。;%。;%。;%0;;接种量5%;装液量80ml/500ml瓶。实施例3:按照实施例2所述的培养基配方配置1L液体培养基,接入菌种后在28'C培养48h(摇床转速220卬m),加入底物妊娠烯醇***,再于28'C转化96h。TLC监测转化终止后(原料点消失),过滤除去菌丝体,发酵液用乙酸乙酯萃取4次,合并有机相,减压浓縮,然后分别用饱和碳酸氢钠溶液洗3次、饱和***化钠溶液洗l次、水洗3次,再用无水硫酸钠干燥,减压蒸干溶剂,,柱层析分离(乙酸乙酯***仿1:1)得到羟基化产物1256mg,%,化合物2487mg,%,结构如图所示,实验数据如下-化合物1:';'H靈(400MHz,CDC13,TMS):(m,1H,H-6,J=5,2Hz),(s,1H,H-7),(s,1H,H_3)
,(t,1H,H-17,J=,J=),(s,3H,H_21),(s,3H,H-19),(s,3H,H—18):13CNMR(,CDC13,TMS):,,,,,,,43,8,,,,,,,',,22,9,,,;HR-MSm/z:[M+H]+()。化合物2:';'HNMR(400MHz,DMS0-d6:TMS):(d,1H,H-6,J=),(m,1H,H-11,J=,J=),(t,1H,H-7,J=,J=),(m,1H,H-3),(s,3H,H_21),(s,3H,H_19),(s,3H,H-18);1:!C醒R(100,6MHz'DMS0-d6,TMS):'',,,',''''',,,,,,,,;HR-MSm/z:[M+Na]+()。实施例4:按照实施例3的方法转化底物黄体***,其中化合物3397mg,%,化合物4202mg,%,化合物5176mg,%,结构如图所示formulaseeoriginaldocumentpage9化合物3:C21H3。';'HNMR(400MHz,CDC13,TMS):(s,1H,H-4),(t,1H,H-17,J=
,J=),(s,3H,H-21),L20(s,3H,H-19),(s,3H,H-18);',CNMR(,CDC13,TMS):,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;HR-MSra/z%:[M+Na]+()。化合物4:-';'HNMR(400MHz,CD:,OD,TMS):(s,1H'H-4),(s,1H,H-7),(t,1H,H-17,J=8,3,J=),(s,3H'H-21),(s,3H'H-19),(s,3H,H-18);':'C醒R(,CD30D,TMS):5213,04,,,,,,,,',,,,,,,',',;HR-MSm/z%:[M+Na]'()。化合物5:C21H3。—';lHNMR(400MHz,DMS0-d6,TMS):(s,1H,H_4),(s,1H,H_6),(t,1H,H_17,J=,J=),(s,3H,H-21),L28(s,3H,H-19),0,66(s,3H,H-18);13CNMR(,DMS0-d6,TMS):,,,,,,59,38,,,,,34,48,
,,,,,,,'16,90;HR-MSm/z%:[M+Na]+()。实施例5:按照实施例3的方法转化底物3-乙酰氧基-17-乙酰氨基5-烯-,,柱层析分离得到化合物6550mg,%,化合物7320mg,%,结构如图所示formulaseeoriginaldocumentpage10
formulaseeoriginaldocumentpage10
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化合物6:CnH萬.'HNMR(400MHz,DMS0-d6,TMS):(d,1H,N-H,J=),(d,1H,H-6,J:),(d,1H'3—OH,J=),(dd,1H'H-17,J=,J=),(m,1H'H_3),(s,3H,H_21),(s,3H'H-19),、s,3H,H-18);l3CNMR(,DMSO-d6,TMS):,,,,,,,,,,',,,,',,,,:HR-MSm/z%:[M+Na]+()。化合物7:C21H33N03.'HNMR(400MHz,DMSO-d6,TMS):(d,1H,N_H,J=),(s,1H,H-6),(d,1H,3_0H,J=),(d,1H,7_0H