根癌农杆菌介导的基因转移.doc

文档介绍：根癌农杆菌介导的基因转移
一、实验目的:
2、掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术流程。
二、实验原理:
根癌农杆菌含有Ti质粒,它是根癌农杆菌所特有的位于染色体外独立的基因组,为双链闭合环状的DNA分子,Ti质粒上含有一段特殊的DNA----T-DNA。当植物受到伤害后,植物的细胞就会分泌如乙酰酊香酮等类的酚类化合物,这些酚类化合物能诱导根癌农杆菌染色体毒性基因的表达,促使农杆菌附着到受伤植物细胞表面。根癌农杆菌侵染植物后,其Ti质粒上的T-DNA部分转化并整合进入植物宿主细胞内,可以诱导植物细胞形成冠瘿瘤。经一系列复杂的变化过程,T-DNA 以单拷贝或低拷贝的形式随机整合到植物染色体上。因此,只要将外源基因插入到T-DNA ,Ti 质粒就可以作为天然载体,将外源基因导入到植物细胞中。
三、实验材料:
(一)根癌农杆菌(含有外源基因)
烟草叶片
(二)溶液与缓冲液
1、MS基本培养基(PH=)
2、烟草愈伤组织诱导或分化培养基(MSH):MS +NAA mg/L +6-BA
3、烟草脱菌培养基:MSH+300 mg/L Cef
4、烟草筛选培养基:MS+300 mg/L Cef+20 mg/L Hpt
5、烟草生根培养基:1/2 MS
6、LB液体培养基:酵母提取物5 g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L(PH=)
7、无菌蒸馏水、10% NaClO、75%乙醇、Kan、Cef、Hpt母液
四、仪器设备及耗材:
无菌培养皿、封口膜、剪刀、镊子、手术刀、三角瓶、无菌滤纸、恒温摇床、微量移液器、吸头、超净工作台等等
五、实验方法与步骤:
(一)、实验准备工作:
1、培养基的制备: MS基本培养基(PH=)、烟草愈伤组织诱导或分化培养基(MSH)、烟草脱菌培养基、烟草筛选培养基、烟草生根培养基、LB液体培养基(PH=)
高压灭菌锅中121℃,灭菌20min。
2、10% NaClO、75%乙醇、Kan、Cef、Hpt等母液制备。
(二)、无菌受体材料的准备:
1、无菌试管苗培养:,加入75%乙醇浸泡2min,用无菌蒸馏水冲洗3-5次,然后用10% NaClO 浸泡20min,无菌蒸馏水冲洗3-5次,播种至MS基本培养基中,于16h、12000lx光照和8h 黑暗25℃、70%相对
湿度的条件下培养。
2、取自田间的叶子,需要先用自来水将其冲洗干净,75%乙醇浸泡
,用无菌蒸馏水冲洗3-5次,然后用10% NaClO 浸泡20min,无菌蒸馏水冲洗3-5次,可用做转化的无菌材料。
(三)、根癌农杆菌培养及浸染悬浮液的制备:
1、从平板上挑取单菌落,接种到20ml附加抗生素的LB液体培养基中,在恒温摇床上
28℃、180r/min隔夜培养。
2、离心管取20ml培养好的菌液,6000rpm离心10m