水合淫羊藿素的制备方法.docx

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专利名称:水合***羊藿素的制备方法
技术领域:
本发明涉及天然化合物的合成,特别是涉及一种中药***羊藿中的成分水合***羊藿素的制备方法。
背景技术:
***羊藿是常用的中药材,是小檗科(Berberridaceae)***羊藿属(Epimediumgenus)多种植物的地上干燥部分,中华人民共和国药典(2000版)收录了如下五种***羊藿药材,即***羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim))、箭叶***羊藿(Epimediumsagittatum)、柔毛***羊藿(Epimediumpubescens)、巫山***羊藿(Epimedium篇shanenes)、朝鲜***羊藿(EpimediumkoreanumNakai)等。***羊藿具有补肾壮阳、强筋健骨、袪风除湿之功效,常用于治疗阳痿不举、小便淋漓、腰膝无力以及冠心病、慢性支气管炎、神经衰弱和小儿麻痹等症。现代药理研究证明,***羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性。
水合***羊藿素,化学名3,5,7-三羟基-4'-甲氧基-8-(3-***-3-羟基)-丁基-黄***。化学结构(I)所示。complexformulaseeoriginaldocumentpage3(I)
天然水合***羊藿素有两种来源,一种是游离的水合***羊藿素,早期有报道可从朝鲜***羊藿中分离得到;另一种是来源于与糖结合的甙,经水解可得。但因其在植物中含量很低,
古女无法进^亍工业化制备(ChemicalandpharmacologicalinvestigationsofEpimediumspecies:asurvey,:60,1-57。***羊藿的研究新进展,中国药学杂志,1997,32,449-451)。
发明内容
***羊藿苷,化学命名为3,5,7-三羟基-4'甲氧基-8-异戊烯基黄***-3-0-α-L-吡喃
鼠李糖-7-"e-D-吡喃葡萄糖苷。其结构式如(II)所示
complexformulaseeoriginaldocumentpage4
(II)
因天然存在的***羊藿苷在植物中含量丰富,故本发明提供一种从***羊藿苷制备水合***羊藿素的方法,反应收率较高,整个工艺过程操作简便,反应后处理方便,纯化简单。
一种水合***羊藿素的制备方法,其特征在于包括由***羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到。
上述水解反应步骤是***羊藿苷经盐酸水解后再用纤维素酶水解。
所述盐酸水解反应中,盐酸浓度为1N-5N,反应物比例为每lg***羊藿苷与20-100mL盐酸液反应,反应温度为50-100°C,-2小时。
优选盐酸浓度为3N,比例为每lg***羊藿苷与50mL盐酸液反应,反应温度为
80°C,加热时间为1小时。
所述纤维素酶水解反应中,反应条件为40-50°C,--磷酸氢二钠缓冲液中将上述盐酸反应产物用纤维素酶水解24-36小时,所述纤维素酶综合酶活力^。
优选反应条件为40'C,-磷酸氢二钠缓冲液中将上述盐酸反应产物用纤维素酶水解36小时。
一种水合***羊藿素的制备方法,还包括水合***羊藿素的纯化,所述纯化包括用溶剂从水解反应混合物中萃取、采用大孔吸附树脂去除杂质和甲醇-水溶液重结晶三个步骤。
所述溶剂为乙酸乙酯。
所述大孔吸附树脂上水合***羊藿素的吸脱采用50%,60%,70%乙醇-水溶液依次洗脱。所述甲醇-水溶液含甲醇95-98%(V/V)。
从***羊藿苷到水合***羊藿素,关键是不仅要将***羊藿苷的3-,7-上的糖取代基水解掉,而且要在***羊藿苷的8-异戊烯基上加合一分子水,使其生成水合***羊藿素。发明人作了长期的研究和探索,发现纤维素酶能水解7-葡萄糖取代基,但只水解少量的3-鼠李糖取代基。盐酸溶液能完全水解3-鼠李糖取代基,但部分水解7-葡萄糖取代基,同时盐酸的水解反应能在双键上与一分子水形成加合反应。在不同浓度的盐酸溶液中,不同的反应温度下,以及不同的盐酸和纤维素酶水解顺序中,其生成的水合***羊藿素的得率是不同的。本发明优
选第一步用3N盐酸与***羊藿苷反应,第二步用纤维素酶水解,可得到比其他已尝试的其他
方法更高的水合***羊素得率。
本发明制备的水合***羊藿素的纯化在酶解反应后直接用乙酸乙酯从反应液中萃取出水合***羊藿素。乙酸乙酯层经过滤可除去不溶杂质,作为第一次纯化,并可用于下一步的纯化处理。
下步纯化步骤包括将上述含有反应产物的乙酸乙酯层用大孔吸附树脂拌样,回收乙
酸乙酯,反应产物吸附于树脂上,拌样后的树脂加于大孔吸附树脂柱上,用50%,60%,70%乙醇溶液依次洗脱,收集含有水合***羊藿素的馏分,浓縮回收乙醇至小体积,即有水合***羊藿素沉淀析出。析出的水合***羊藿素用95-98%甲醇反复多次溶解,过滤,浓縮,析出,可得到99%以上的纯度,并使水合***羊藿素呈针状结晶。
本发明采用盐酸和纤维素酶对水合***羊藿苷进行反应,其去糖水解完全,并可改变***羊藿苷元的化学结构,使其成为水合***羊藿素,且收率较高。反应后处理方便,产物纯度完全符合药用标准。
图1实施例1制得的水合***羊藿素HPLC图谱
图2实施例1制得的水合***羊藿素X散射图谱
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
***羊藿苷与盐酸溶液的反应
取***羊藿苷5g(含量90%以上),加入至250mL3N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按3:7的体积比配制),搅拌,逐步升温至80°C,并维持1小时。反应结束后,冷却,放置,使沉淀完全。过滤,沉淀物用水洗涤数次至中性(如无法洗至中性,可用少量NaOH溶液中和酸性)。滤液弃去或留至下次反应用。

将上述的盐酸反应产物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(,50uM)的缓冲液中,再加入纤维素酶(综合酶活力》)约5mL,于40。C搅拌36小时。反应结束后,冷却,加入等量乙酸乙酯萃取两次,合并乙酸乙酯层,过滤,除去不溶性杂质。

上述乙酸乙酯溶液中加入约50gDM130树脂拌样,回收乙酸乙酯至干。拌样后的树脂加于200g大孔吸附树脂柱上,用50%,60%,70%乙醇溶液依次洗脱,收集含有水合***羊藿素的馏分,浓縮回收乙醇至小体积,既有水合***羊藿素沉淀析出。过滤,得水合***羊藿素粗品约2g,得率约为40%。
***羊藿素纯品制备
收集到的水合***羊藿素粗品,用95-98%甲醇600mL加热溶解,过滤除去杂质,浓縮至约150mL,有结晶析出。如此反复用甲醇结晶约6-10次,并用高效液相监测纯度,直至达到药用标准。可得水合***。高效液相流动相为乙***%磷酸水溶液,比例为52:48,色谱柱为C18,,5um。水合***羊藿素保留时间约为18min。见图1。

***羊藿素,甲醇-水重结晶,得黄色针状晶体,熔点为238-9℃。

NMR仪器BruckerAM-400NMRSpectrometer.
溶剂DMSO
测试项目1H,13C,DEPT-135。
测试结果:力-NMR:L18(6H,s);(2H,m);(2H,m);(3H,s);(1H,s);(1H,s);(2H,d,J=9Hz);(2H,d,J=9Hz);(1H,s);(1H,s);(1H,s)。13C-NMR:;;;;;;;;;;;;;;;;;。

MS仪器AgilentLC/.
测定结果(M+H)+m/。
.
实施例2
***羊藿苷与纤维素酶的反应
取***羊藿苷5g(含量90%以上),加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(,50uM)的缓冲液中,再加入纤维素酶(综合酶活力》)约5mL,于50。C搅拌24小时。反应结束后,冷却,放置,使沉淀完全。过滤,沉淀物用水洗涤数次。

将上述的酶解产物加入至500mL1N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按1:10的体积比配制),搅拌,逐步升温至60。C,并维持8小时。反应结束后,冷却,放置,使沉淀完全,过滤。沉淀物用水洗至中性。
(同实施例l),得率约为10%。
***羊藿素纯品制备(同实施例l)
实施例3
***羊藿苷与盐酸溶液的反应
取***羊藿苷5g(含量90%以上),加入至500mL1N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按1:10的体积比配制),搅拌,逐步升温至
80°C,并维持8小时。反应结束后,冷却,放置,使沉淀完全。过滤,沉淀物用水洗涤数次至中性(如无法洗至中性,可用少量NaOH溶液中和酸性)。滤液弃去或留至下次反应用。

将上述的盐酸反应产物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(,50uM)的缓冲液中,再加入纤维素酶(综合酶活力》)约5mL,于40。C搅拌32小时。反应结束后,冷却,加入等量乙酸乙酯萃取两次,合并乙酸乙酯层,过滤,除去不溶性杂质。(同实施例l),得率约为20%。***羊藿素纯品制备(同实施例l)
权利要求
1、一种水合***羊藿素的制备方法,其特征在于包括由***羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到。
2、根据权利要求1所述的制备方法,所述水解反应歩骤的顺序是***羊藿苷经盐酸水解后再用纤维素酶水解。
3、根据权利要求2所述的制备方法,所述盐酸水解反应中,盐酸浓度为1N-5N,反应物比例为每lg***羊藿苷与20-100mL盐酸液反应,反应温度为50-100°C,-2小时。
4、根据权利要求3所述的制备方法,所述盐酸浓度为3N,反应物比例为每lg***羊藿苷与50mL盐酸液反应,反应温度为
80°C,加热时间为1小时。
5、根据权利要求2所述的制备方法,所述纤维素酶水解反应中,反应条件为40-50'C,--磷酸氢二钠缓冲液中将盐酸水解反应产物用纤维素酶水解24-36小时,所述纤维素酶综合酶活力^。
6、根据权利要求5所述的制备方法,所述反应条件为40'C,-磷酸氢二钠缓冲液中将盐酸水解反应产物用纤维素酶水解36小时。
7、根据权利要求1所述的制备方法,还包括水合***羊藿素的纯化,所述纯化包括用溶剂从水解反应混合物中萃取、采用大孔吸附树脂去除杂质和甲醇-水溶液重结晶三个步骤。
8、根据权利要求7所述的制备方法,所述溶剂为乙酸乙酯。
9、根据权利要求7所述的制备方法,所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂,水合***羊藿素的洗脱采用50%,60%,70%乙醇-水溶液依次洗脱。
10、根据权利要求7所述的制备方法,所述甲醇-水溶液含甲醇95-98%(V/V)。
全文摘要
本发明涉及“水合***羊藿素的制备方法”,属于天然化合物的合成领域。一种水合***羊藿素的制备方法,其特征在于包括由***羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到。其去糖水解完全,并可改变***羊藿苷元的化学结构,使其成为水合***羊藿素,且收率较高。反应后处理方便,产物纯度完全符合药用标准。