文档介绍：该【2018级天然实验 】是由【江湖故人】上传分享，文档一共【6】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【2018级天然实验 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。实验一(1)叶绿体色素的提取
一、实验目的
掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。
二、实验原理
植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源。在把光能转
化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用。高等植物体内的叶绿体色素有
叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。它们所
呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表1。
表1高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量
色素名称叶绿素类胡萝卜素
项目叶绿素a叶绿素bβ-胡萝卜素叶黄素
颜色蓝绿色黄绿色橙黄色黄色
3121
在叶绿体内各色素含量比例
31
叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转
变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。在绿色植物中叶绿素主要以叶绿
素a(CHONMg)和叶绿素b(CHONMg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是
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叶绿素a中一个***被叶绿素b中的甲酰基所取代。叶绿素的基本结构见图1。在叶绿素分子
结构中含有四个吡咯环,它们由四个甲烯基联结成卟啉环,在卟啉环中央有一个镁原子,它
以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐,形成镁卟啉。在叶绿素分
子中还有两个羧基,其中一个与甲醇酯化成COOCH,另一个与叶绿醇酯化成COOCH长
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链。
类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物(例如胡萝卜素,carotenes),
或它们的氧化衍生物(例如叶黄素类,xanthophylls)。所有的类胡萝卜素均源于非环状的
结构。类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化;在弱光下,可作为辅助色素吸收
C40H56
光能并传递给叶绿素分子。胡萝卜素有三种异构体,即α−、β−和γ−胡萝卜素,其中β−胡
萝卜素含量最多,也最为重要。β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性,其结构是由两分
子维生素A在端链失去两分子水结合而成。在生物体内,β−胡萝卜素受酶催化氧化即形成维
生素A。叶黄素(3,3`-二羟基-α-胡萝卜素,lutein,C40H56O2)是一种常见的氧化型的类胡
萝卜素。β−胡萝卜素和叶黄素均属于脂溶性化合物。
植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定在植物生理学和农业科学研究中具有重
要意义。同时,叶绿素和胡萝卜素等天然色素在食品工业和医药工业中也有广泛的用途。
叶绿素a和b都是吡咯衍生物与金属镁的配合物,尽管它们分子中含有一些极性基团,
但大的烷基结构使它们易溶于***、乙醇、***、石油醚等有机溶剂。β−胡萝卜素和叶黄
素是脂溶性的四萜化合物。与胡萝卜素相比,叶黄素易溶于醇而在石油醚中的溶解度较小。
根据它们在有机溶剂中的溶解特性,可将它们从植物叶片中提取出来。植物叶绿体色素通常
可用***、乙醇、***、***-***、甲醇-石油醚等有机溶剂提取。由于粗提取液中还可
能包括残余植物组织和其它可溶性杂质,实验中应对粗提液进一步纯化。
三、实验仪器与试剂
研钵、量筒、分液漏斗等常用玻璃仪器一套。
***、乙醇、***、石油醚等有机溶剂。饱和***化钠水溶液。碳酸镁和无水硫酸钠。
四、实验步骤
方法一:采集新鲜树叶,洗净后弃除叶柄和中脉,然后用纱布或吸水纸将树叶表面的
水分吸干。称取处理过的树叶3g,剪碎后放在干净的研钵内,,先将树叶
粗捣烂,然后加入10mL乙醇-石油醚(2:3),迅速研磨5min。过滤去树叶残渣,再研磨
提取一次。最后再用10mL乙醇-石油醚(2:3)洗涤研钵等容器,一并过滤。
方法二:类似于方法一,采用***提取,但在纯化时应事先在分液漏斗中加入15mL
石油醚。
纯化色素时,将合并的滤液转入分液漏斗,加入5mL饱和的NaCl溶液和45mL蒸馏水,
轻轻振,荡放置分层。小心地把下层的含乙醇水溶液放掉,用洗瓶沿分液漏斗内壁加入50mL
蒸馏水洗涤石油醚层2~3次,以彻底洗去乙醇或***。每次都要轻轻转动分液漏斗,使叶绿
体色素保留在上层的石油醚层中,静置,待分层清楚后,去掉下面的水溶液。再往石油醚色
素提取液加入少量无水NaSO除去残余水分,然后转入具塞的棕色瓶中置于暗处保存。
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五、注意事项
、温度、氧气环境、酸碱及其它氧化剂都非常敏感。色素的提取和分析一
般都要在避光、低温及无酸碱等干扰的情况下进行。***使用前应重蒸除去过氧化物。
。实验室要保持良好的通风条件,不得靠近
明火操作。
,必要时应抽干充氮避光低温保存。
六、思考题
?提取液可能含有哪些化合物?
?残余的植物组织应如何除去?
-石油醚提取和用***提取可能对结果产生什么影响?
实验一(2)叶绿体色素的色谱分离
一、实验目的
。
。
二、实验原理
色谱法是与植物天然色素的分离提取同时发展起来的。色谱法(纸色谱、薄层色谱和柱
色谱)至今仍然是分离叶绿素等天然色素最有效的方法。
色谱法分离叶绿体色素的基本原理是利用不同色素在各种有机溶剂中的分配系数,或在
吸附剂上的吸附能力的不同,当它们通过色谱柱/床时,这种分配或吸附过程反复多次地进
行,最后将它们一一分离开来。
通常认为,纸色谱属于分配色谱。它是以滤纸为惰性支持物,滤纸纤维一般能吸收约
20%的水分,其中有6~7%以氢键形式与纤维素上的羟基结合,构成纸色谱的固定相。在
展开过程中,被分离组分在展开剂和固定相之不间断进行分配,达到相互分离。薄层色谱和
柱色谱的吸附剂(固定相)有硅胶、氧化铝、硅藻土等无机物,也有糖类、纤维素、聚酰***、
C和离子交换树脂等有机物。它们的分离机理也各不相同,如吸附、分配,氢键、正相和
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反相色谱等。
对于纸色谱或薄层色谱,毛细管作用是推动溶剂展开的动力。被分离物质在图谱上的
位置,可用比移值R表示。
f
比移值的大小与被分离物质的分配系数大小有关,它是纸色谱法和薄层色谱法实验中
唯一可用数值表示的重要参数。在一定的色谱系统中,在确定的温度下,R是被分离物质的
f
特征常数。R值差别越大,则分离越完全。
f
对于相同的色谱体系,薄层色谱的R值与液相色谱的容量因子k值之有一定的间关系
f
即在薄层色谱中展开快的组分,在柱色谱中先出峰。通过薄层色谱实验可以探索高效液相色
谱合适的流动相组成。
值得一提的是快速柱色谱(FlashChromatography),它是介于经典柱色谱和高效制备
型液相色谱之的一种实验间室分离技术,主要用于天然产物和化学反应产物的快速分离和纯
化工作。
本实验通过纸色谱、薄层色谱和快速柱色谱方式,对植物色素的提取液进一步分离成
叶绿素a、叶绿素b、β-胡萝卜素和叶黄素几个组分,并进行光谱表征和鉴定其纯度。通过多
次纸制备色谱也可以得到少量叶绿素a和叶绿素b纯品。
三、实验仪器与试剂
层析缸、大量筒、表面皿、带有加压装置的玻璃层析柱等常规层析装置。
(1)乙酸乙酯、石油醚、***、乙醇等有机溶剂。
(2)硅胶H。
四、实验步骤
薄层色谱是一种较新的分离物质的方法,具有快速、微量、灵敏度高、分离效率好等优
点。薄层色谱对天然产物的分离、鉴定更有独到之处,草药有效成分的纯化鉴定中广泛
应用。分离叶绿体色素的薄层色谱吸附剂有硅胶、纤维素、聚酰***、C等。下面仅介绍常
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用的硅胶薄层色谱法。
(1)薄层板的制备
取若干块洗净的载玻片,采用用羧***纤维素钠作粘合剂,取硅胶H(200~250目)1份,
%羧***纤维素钠溶液2份,充分调匀后,即可涂铺,晾干后在105℃,
放在干燥器内备用。
(2)点样
取制备好的薄层板一块,在板两侧距底边1cm处各做一记号,用玻璃毛细管吸取浓缩的
色素石油醚提取液,点样,斑点不应超过5mm,晾干。
(3)展开
分离叶绿体色素的展开剂有:石油醚(60~90℃)-***-***(3:1:1);石油醚-***
(8:2);石油醚-乙酸乙酯(6:4);苯-***(7:3)和石油醚(30~60℃)-***-正丁醇(90:10:)
等。
本实验将150mL石油醚(60~90℃)-***-***(3:1:1)展开剂倒入层析缸中,并在层
析缸的内壁四周贴一张5cm高的滤纸,滤纸下部浸在展开剂中,盖好盖子平衡10~15min。
将点好样的硅胶板放入展开缸里,液面不能超过点样线,盖好盖子进行上行层析。待展开剂
~2cm时,取出硅胶板置于通风橱里晾干,可看到层析板上出现
若干色素带,其排列顺序一般是β-胡萝卜素、去镁叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和叶黄素等多
条色带。用铅笔标记出样品斑点,计算各色素的比移值R。
f
(4)样品收集
将层析板上分开的β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b的色带分别用干净的刮刀刮入试管
中,加入5mL***提取,低温避光保存。
色谱法分离得到的样品组分,可用吸收光谱(400~700nm)和荧光光谱进行表征和鉴
定。其纯度也可通过薄层色谱点板实验和后面介绍的三种测定技术进行测定。
五、注意事项
,提取过程应尽可能在弱光或暗室中进行。
。实验室要保持良好的通风条件,使用有
机溶剂不得靠近明火操作。
,必要时应抽干充氮避光低温保存。
六、思考题
,其“高效性”在于独特的色谱分离过程。结合本实验观察到
的植物色素分离过程,联想和体会GC和HPLC的分离过程。
,而不直接用***提取液?
,叶绿体色素在硅胶薄板,异辛烷—***—***(3:1:1)和反相C薄板,甲醇
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—***—水(20:4:3)的展开顺序正好相反,试解释这一现象。