文档介绍：该【毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含移植用再生毛囊原基的组合物...的制作方法】是由【421989820】上传分享，文档一共【42】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含移植用再生毛囊原基的组合物...的制作方法】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含移植用再生毛囊原基的组合物...的制作方法
毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含移植用再生毛囊原基的组合物...的制作方法
提供通过毛囊原基的移植使毛发再生的技术,其中再生毛发的颜色受控制。移植后生长的毛发的颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法,所述方法包括:制备包含间叶细胞的第1细胞集合体的步骤;制备包含上皮细胞的第2细胞集合体的步骤;制备包含色素干细胞的细胞集合体的步骤;使所述第1细胞集合体和所述第2细胞集合体中的至少一方与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的步骤;以及,接下来使其中至少一方已与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的所述第1细胞集合体与所述第2细胞集合体彼此紧密接触,并在支持体内部培养这些细胞集合体的步骤。
【专利说明】毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含
移植用再生毛囊原基的组合物和再生毛囊原基的移植方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含所述移植用再生毛囊原基的组合物,以及所述移植用再生毛囊原基的移植方法。
【背景技术】
[0002]再生医疗是将因各种疾病或外伤而变得功能不全的脏器或器官更换为再生的脏器或器官的技术,其有希望作为下一代医疗技术以对移植医疗进行补充(非专利文献I)。在目前的再生医疗研究中,在干细胞移植疗法方面已取得进展,该方法是在受伤的组织或部分功能障碍的器官移入干细胞或前体细胞而恢复其功能。
[0003]在由如皮肤或角膜上皮细胞、心肌细胞等单一种类的细胞种所构成的二维组织的再生方面,一种组织再生技术也已接近实际应用阶段,在该技术中通过使用细胞片层技术将细胞培养成片层形式来对细胞进行组织化。其中,通过使作为间叶细胞的成纤维细胞与皮肤表皮细胞分层化以人为地再现组织学上所适合的层状构造,能够使功能性的皮肤组织再生,该技术已临床应用于重度烫伤的治疗方面。
[0004]另一方面,已知的是,在器官中,多种功能细胞是呈三维配置的,以表现出独特的功能。几乎全部的器官都是通过胚胎期的上皮细胞与间叶细胞的相互作用所产生,从而展现特有的形态和器官功能。在目前的再生医疗技术中,难以将多种细胞以三维的形式进行配置,能够在活体外立即发挥功能的再生器官构造目前还没被开发出来。
[0005]最近,在如牙齿和唾液腺等外胚层附属器官、和如毛囊等皮肤附属器官方面正在进行一种以器官再生为目标的研究,通过使器官原基再生而再现出发育的过程。这些器官不直接关系到生命的维持,但已知它们会陷入器官丧失或功能不全的状况。作为这样的例子可列举由龋齿
、损伤或牙胚发育不全造成的牙齿的丧失、或者随着老龄化而发生的唾液分泌障碍、男性型脱发症或毛囊发育不良造成毛发的丧失等。这样的器官丧失或功能不全会对QOL(生活品质)造成很大的影响,因此通过器官再生而进行的功能恢复受到很高的期待。
[0006]一般而言,哺乳类或鸟类中,毛发、羽毛及爪等外胚层皮肤附属器遍布于皮肤,具有生存或生殖等物种特异的功能。在哺乳类中,毛发具有保持体温或者对外伤及紫外线的防御功能。进一步,在灵长类等高级哺乳类中,毛发在体表产生特征性的颜色和花样,认为这在生殖种群内展现等级或生殖能力上是有用的。而且,当毛发在特定部位大量存在时,它根据其在体表的区域或功能而在粗细、硬度、颜色等毛发质量上产生差异,并展现审美上和功能上的价值。尤其是在人类中,头发的颜色和质量具有社会意义,认为因年龄增长或疾病所导致的其发生的变化对个人的QOL(生活品质)造成很大的影响。
[0007]为了建立足以临床应用的毛囊再生医疗技术,必须使再生毛囊具有正常的组织构造且具有适合于移植部位的毛干的毛发形成和伸长。这种包含毛发等皮肤附属器官的外胚层附属器官通常是通过胎儿期时上皮细胞和间叶细胞的相互作用而产生。作为皮肤附属器
官,毛囊会在个体的整个生命期重复成长与退化(毛发周期)。已知在成长期的毛球部的再生,是由与毛囊器官新生期时的相似的分子机理所诱导出来。另外还认为在这样的毛发周期中,毛球部的再生是通过作为间叶细胞的毛乳头细胞所诱导出来。此外,认为在成长期中,作为间叶细胞的毛乳头细胞分化诱导毛囊上皮干细胞以再生出毛球。另外由于在隆突(bulge)区域及隆突区域下方的区域中,存在有来自神经嵴的干细胞的龛(niche),因此认为毛囊会保持住多个干细胞龛并发挥干细胞库的功能。
[0008]至目前为止,已进行了一些关于毛囊再生的尝试,如通过取代间叶细胞(毛乳头细胞及真皮毛根鞘细胞)以进行毛囊可变区域的再生、通过具有毛囊诱导能力的间叶细胞进行毛囊新生、通过上皮/间叶细胞进行毛囊的再构建等。此外,最近本发明的发明人等证明了通过器官原基法(例如参考专利文献I),从来自成体小鼠胡须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠胡须的培养的毛乳头细胞再构建的再生毛囊原基模仿了正常的发育,并能够使毛囊与毛发再生。然而,使用来自成体小鼠胡须的再生毛囊原基进行毛囊再生时,存在有几乎所有的再生毛发成为白色毛发的问题。
[0009][文献列表]
[0010][专利文献]
[0011][专利文献I]国际公开第2006/129672号册子
[0012][非专利文献]
[0013][非专利文献I]SharpePT,-,34-41,2005
【发明内容】
[0014](本发明要解决的技术问题)
[0015]如上所述,至今还没有足以临床应用的毛囊再生技术的任何报道,尤其是关于控制毛发颜色的毛囊再生技术的任何报道。尤其是将毛发再生技术应用于人类时,必需从来自成体的组织获得毛发颜色受控制的再生毛发,因此强烈期望有控制来自成体组织的再生毛发的毛发颜色的方法。
[0016](解决问题的方法)
[0017]为了解决上述问题,本发明的发明人等首先着眼于掌管毛发颜色的黑色素母细胞(melanoblasts)的分布与其分布区域,分析存在于每个分布区域的细胞功能。然后,本发明的发明人等通过应用所述黑色素母细胞分布区域所含细胞的功能,而发现了毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法。
[0018]亦即,本发明是关于移植后生长的再生毛发的颜色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法,所述移植用再生毛囊原基的制造方法包括:制备包含间叶细胞的第I细胞集合体的步骤,制备包含上皮细胞的第2细胞集合体的步骤,制备包含色素干细胞的细胞集合体之步骤,使所述包含色素干细胞的细胞集合体与所述第
I细胞集合体和所述第2细胞集合体中的至少一方结合的步骤,以及,接下来,使其中至少一方与所述包含色素干细胞的细胞集合体结合的所述第I细胞集合体与所述第2细胞集合体紧密接触,并在支持体内部培养它们的步骤。
[0019]在此,在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中,所述第I细胞集合体实质上由间叶细胞所构成。[0020]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中,所述第2细胞集合体实质上由上皮细胞所构成。[0021]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中,所述包含色素干细胞的细胞集合体经过单一化处理。[0022]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基制造方法的一个实施方案中,所述色素干细胞是源自次级隆突(subbulge)区域的黑色素母细胞或源自毛母基底部(hairmatrixbase)的黑色素细胞前体细胞。[0023]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,当使所述细胞集合体结合在一起时,所述第I细胞集合体的细胞数或所述第2细胞集合体的细胞数,:1至100:1的范围内。[0024]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,所述间叶细胞是毛乳头细胞或真皮毛根鞘细胞。
[0025]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,所述上皮细胞是隆突区域上皮细胞或毛母基底部上皮细胞。[0026]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,所述间叶细胞或上皮细胞源自成体的毛囊。[0027]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,所述方法进一步包含将导引器(guide)插入到所述再生毛囊原基中的步骤。[0028]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,移植所述再生毛囊原基时所再生的再生毛囊包含黑色素母细胞的干细胞龛。[0029]另外,在本发明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一个实施方案中,移植所述再生毛囊原基时所再生的再生毛囊能够永久地形成有色毛发。[0030]本发明的另一实施方案涉及包含毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的组合物,所述移植用再生毛囊原基是通过上述移植用再生毛囊原基的制造方法而制作的。[0031]另外,本发明另一实施方案涉及毛发颜色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法,所述移植方法包括将通过上述移植用再生毛囊原基的制造方法而制作的移植用再生毛囊原基移植到作为对象的部位的步骤。[0032]而且,在本发明的移植用再生毛囊原基的移植方法的一个实施方案中,通过将所述导引器维持在突出于移植部位的状态,使所移植的再生毛囊原基的上皮细胞侧的部分与所述对象的上皮细胞沿着所述导引器伸长并连接。
[0033](发明效果)[0034]根据本发明,通过使用在制作再生毛囊原基时与上皮细胞或间叶细胞分开制备的色素干细胞,能够制作移植后最初生长的毛发为有色毛发的移植用再生毛囊原基。进一步,通过本发明所制作的移植用再生毛囊原基,能够再生不仅具有毛发颜色并且具有正常毛干的毛发。[0035]另外,在本发明的一个实施方案中,在再生毛囊中能够形成黑色素母细胞的干细胞龛,其中所述再生毛囊是由本发明所制作的移植用再生毛囊原基的移植后所再生的。从而毛囊中的黑色素母细胞的干细胞龛能够在维持黑色素母细胞的同时,适当地提供黑色素细胞,因此经过较长的时间能够形成有色毛发。【专利附图】
【附图说明】[0036]图I表示毛囊中的黑色素母细胞与黑色素细胞前体细胞的分布的示意图。在毛囊的次级隆突区域存在分布有黑色素母细胞的黑色素母细胞龛,在毛母基底部分布有黑色素细胞前体细胞。图I中,DP表示毛乳头,SG表示皮脂腺。[0037]图2表示移植通过下述三个条件制作的再生毛囊原基后,毛囊再生和毛发生长的移植部位的立体显微镜的照片(图2a_2c)。图2a表示移植由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基的毛发生长部位(对照组)。另外,向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞,进一步添加来自成体小鼠颊须的次级隆突区域细胞,由此制作再生毛囊原基,移植该再生毛囊原基时的毛发生长部位表示于图
2b(次级隆突添加区)。向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞,进一步添加来自成体小鼠颊须的采集自毛母基底部的细胞,由此制作再生毛囊原基,移植该再生毛囊原基时的毛发生长部位表示于图2c(毛母基底部添加区)。在对照组中获得了白色毛发(图2a),而在次级隆突添加区及毛母基底部添加区能够获得黑色毛发(图2b的黑色箭头标记和图2c)。图2b的白色箭头表示白色的再生毛发。[0038]图3表示在天然毛囊或通过移植再生毛囊原基而再生的毛囊的作为黑色素母细胞干细胞龛存在部位的次级隆突区域的外毛根鞘中,进行作为黑色素母细胞的分化谱系标记物的多巴色素互变异构酶(dopachrometautomerase:Dct)的原位杂交(insituhybridization)时的结果。图3的影像是原位杂交后用突光显微镜拍摄的。图3A至3C分别为:(A)具有黑色毛发的天然毛囊;(B)来自再生毛囊原基的具有白色毛发的毛囊,该再生毛囊原基由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作;(C)来自再生毛囊原基的具有黑色毛发的毛囊,该再生毛囊原基通过向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞中进一步添加来自成体小鼠颊须的次级隆突区域细胞(次级隆突添加区)而制作。图
3中的箭头标记表示多巴色素互变异构酶的检出部位。[0039]图4分别表示对由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基(对照组),以及对通过向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞中进一步添加来自成体小鼠颊须的次级隆突区域细胞(次级隆突添加区)或采集自来自成体小鼠颊须的毛母基底部的细胞(毛母基底部添加区)而制作的再生毛囊原基进行移植后,最初生长的毛发的有色毛发率。[0040]图5表示用电子显微镜观察由毛囊生长的毛发的毛干的结果,该毛囊是通过将使用来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞、来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞和采集自来自成体小鼠颊须的毛母基底部的细胞所制作的再生毛囊原基移植至受体小鼠的皮内而再生的。[0041]图6表示通过下述两个条件制作的再生毛囊原基的移植后第36天和移植后第306天,其生长毛发的移植部位的由立体显微镜拍摄的照片。图6的左图和中间图表示对于通过向来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞中进一步添加采集自来自成体小鼠颊须的毛母基底部的细胞而制作再生毛囊原基,移植后第36天和第306天的毛发生长部位(毛母基底部添加区)。另外,图6中,右图表示将由来自成体小鼠颊须的隆突区域上皮细胞与来自成体小鼠颊须的毛乳头细胞所制作的再生毛囊原基移植后,第