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专利名称:毛发增殖的方法
技术领域:
本发明首先涉及毛发再生的方法,还涉及一种培养来自生长期毛发的毛囊细胞的方法,以及非常适于培养毛囊细胞的培养基,和一种制备该培养基的方法及涉及一种前体培养基。
毛发再生的方法见于欧洲专利申请0236014所揭示,其中将所需类型毛发的表皮毛囊细胞从患者的头皮上取下,然后将此表皮毛囊细胞在优选含有生长因子的培养基中培养,接下来在患者头皮的表皮内做一切口,经此切口将培养的表皮毛囊细胞导入表皮下的真皮内。该方法的缺点是其是一种侵害性方法,且细胞不能直接置入,结果需要许多细胞且毛发的再生能力较低,在此方法中所用的也不是自身(培养的)CD34+细胞。
毛发的必需生长结构是所谓的毛囊,其存在于皮肤中,毛囊细胞或角质细胞再生自这些毛囊,且在其突出皮肤表面过程中,所述细胞的细胞质经大量复杂过程被转变成坚韧且有弹力的已知为毛发的物质。毛发的生长周期可以分成三个阶段生长期、退化期或称过渡期及末期或称死亡期。由于毛发的形成及生长的循环性,因而毛囊是独特的,毛囊是身体中唯一具有生长核的部分,从中在旧发退去后可以产生新发。
现已知来自脱落的人毛发的毛囊细胞可以培养。也已知可以利用如此培养的细胞在体内及体外产生分化的表皮或充分发育的表皮。培养的小鼠毛囊细胞当植入受试动物时可刺激毛发生长。但到目前为止尚未能实现借助于培养的自身毛囊细胞,在不希望的人脱发或无发部位获得新发生长。
人们通常从美容和审美角度发现秃发是不合需要的。但秃发经常发生,且知特别是男性在年老时也变得毛发稀疏这一现象。这种秃头的形成已知是雄激素性脱发。目前还不十分清楚为什么头皮的某些部位对雄激素性脱发敏感而其它部位不敏感。而女性也通常发生毛发变得稀薄甚至有大面积脱落的危险。对女性而言从美容和审美角度这一现象尤为不适合。
对付秃头的一种已知方法是植发,此方法中,从通常为头后部的有毛发覆盖的供体区取包括头皮的毛发,切成小片,通常每片只有1-3根毛发,然后将此小片植入秃头区(受体区)。此方法一主要缺点是供体区的消耗。也就是说毛发取自此区,该毛发不能再返回。因而移植技术应用有限制。
本发明的目的在于提供一种技术,借助于该技术,可为秃头部位再提供毛发,且没有上述植发技术的缺点。本发明再一目的是提供一种方法,使用该方法借助于培养的毛囊细胞在人脱发部位可以得到新发生长。本发明另一目的是提供一种相对简单易行的方法。
根据本发明方法可以达到所述目的,其中毛发再生出来。具体地,根据本发明,毛发取自供体区,在此方式中新发返回其部位,同时从所取毛发中培养毛囊细胞,反过来从这些细胞中可以形成新发。
本发明因而涉及一种毛发再生的方法,包括以下步骤(1)从一处或多处供体区取生长期毛发,其中生长期毛发的球状特征仍与所取毛发相附着,(2)在毛囊细胞能增殖条件下,培养来自所取毛发中的毛囊细胞,(3)将培养的毛囊细胞植入受体区,其中—生长期毛发经在供体区拔取,随后选择适当的生长期毛发,—在培养基中培养毛囊细胞,培养基中任选地补加(a)至少一种人肥大细胞系和/或自身(培养的)CD34+细胞,或(b)一种或多种人肥大细胞系的提取物和/或CD34+细胞的提取物,和/或(c)生长刺激剂,—将培养的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞植入受体区的毛孔中。
根据本发明,尽管描述中通常提及了许多细胞,但只有一种毛囊细胞或一种自身(培养的)CD34+细胞,或这二种细胞的组合物可被导入。
本发明方法具有的主要优点是在不损害供体区的情况下在脱发部位可得到毛发生长。
本发明方法的步骤(1)包括从生长期毛发所在的供体区取发。如上所述,毛发生长包括三个阶段生长期、退化期和末期。只有生长期毛发适用于本发明的方法。与退化期和末期毛发相比,生长期毛发特征在于在生长期毛发根部具有通常为有颜色的特征性球状这一形态特点。这已周知且用肉眼也可立即将生长期毛发根据特征性球状形态加以识别。使用显
微镜可以提供一明确答案。取生长期毛发因此可以各种方式进行,只要生长期毛发的特征性球状特性仍与所取毛发相附即可。
需用于培养适量毛囊细胞的生长期毛发数量几乎不受特殊限制,这是由于原则上从一根毛发可以培养无限量的毛囊细胞。从第一个培养物可以依次培养传代培养物且依次从每传代培养物可培养许多培养物。原则上,3-10根生长期毛发就足够了。最终在受体区形成的来自培养的毛囊细胞的毛发呈现培养的毛囊细胞所来自的供体区毛发的特性。因而对雄激素性脱发不敏感的区域可用作合适的供体区。但这不是必需的。
由于一旦毛发被取,在不同生长时期的毛发的差异显而易见,所以经在供体区拔取毛发,并选择合适的生长期毛发而可以从供体区取发。例如,用镊子非常适于在供体区拔取毛发。
在本发明的步骤(2)中,将所取毛发在毛囊细胞可增殖的条件下进行培养。原则上,可用已知方法从毛发培养毛囊细胞。为此目的的培养基是可商购的,且任何相关生长补加剂都是易于得到的。如此培养基也称作无血清角质细胞培养基,且通常含有必需和非必需氨基酸,维生素,微量元素,有机组分和无机盐。该培养基也可与生长补加剂组合,生长补加剂含有生长因子、激素、抗生素及组织提取物如
BPE(牛垂体提取物),胰岛素、氢考、HEGF(人表皮生长因子),TGF(转化生长因子),L-半胱氨酸,L-亮氨酸和庆大霉素。根据本发明,如果在本发明方法的步骤(2)中,所用的培养基除上述已知培养基外,还任选地补加一种或多种生长补加剂,和/或补加人肥大细胞系和/或自身(培养的)CD34+细胞或者一或多种人肥大细胞系的提取物和/或CD34+细胞的提取物和/或生长刺激剂,则可获得特别好的结果。优选地,只使用培养的CD34+细胞,这是由于这些细胞是机体天生的。人肥大细胞是已知的,它们含有各种生长因子,且在机体各种不同部位产生并消耗。人肥大细胞系提取物和/或自身(培养的)CD34+细胞提取物和/或生长刺激剂含有生长因子。但到目前为止这种人肥大细胞系提取物和/或自身(培养的)CD34+细胞提取物和/或生长刺激剂未用于培养毛囊细胞的培养基中。其提取物可被使用的一种人肥大细胞系是HMC-1(人肥大细胞系1)或衍生自其中的一个细胞系,如亚克隆5C6和KU812。肥大细胞系如HMC-1及其亚克隆是可商购的。根据本发明,可用自身(培养的)CD34+细胞或两种或多种这些细胞类型的组合代替肥大细胞。
人肥大细胞系提取物和/或自身(培养的)CD34+细胞提取物和/或生长刺激剂可通过向含有人肥大细胞系,其亚克隆和/或自身
(培养的)CD34+细胞和/或生长剂的无血清角质细胞培养基中加入至少一种脱粒剂而被非常合适地导入培养基中。也可加入无机盐以优化脱粒剂的作用。适当的盐是CaCl2。然后脱粒剂将肥大细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞切割成较小块(脱粒),结果生长因子释入培养基中。脱粒后,可除去肥大细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞的残余物,如可通过离心进行。得到的条件培养基可用于培养毛囊细胞。
脱粒剂是已知的,且可大致分为三组—激素如雌激素和缓激肽,
—神经递质和抗原如蜂毒,P物质及IgE。
—合成试剂如化合物48/80和离子载体A23187。
任选地使用的能使肥大细胞脱粒的脱粒剂适用于本发明的方法。
一种选择是首先单独制备人肥大细胞系提取物和/或自身(培养的)CD34+细胞提取物和/或生长剂,并将这些提取物加入无血清角质细胞培养基中。
步骤(2)中培养毛囊细胞的条件可以变化很大且特别依赖于所用的培养基。但已发现毛囊细胞的培养在30℃-40℃,优选在温育器内以便使温度保持恒定,并在水饱和的且除空气中含有的常量的常规组分外另含有3-10%CO2的环境下可得到好结果。但这些条件是非限制性的,且也可使用其它条件。培养期根据每培养物的不同变化于1小时至40天之间,为得到良好
结果,优选每2-5天以新鲜培养基替换旧培养基。
本发明方法的步骤(2)可以单一培养步骤进行。但也可以通过从初始培养物传代培养以多个传代步骤进行,这可以当主培养物有足够毛囊细胞时从中取足够量的毛囊细胞加以进行。将取自主培养物的毛囊细胞依次培养,优选但非必需在与初始培养物相同的培养基中进行。如果需要,在培养期间可从所述传代培养物培养进一步的培养物,等等。
毛囊细胞经培养之后,必须将其从其生长的基质上分离。这可用已知方法进行,如在PBS中用胰蛋白酶溶液(-%(重)水溶液),任选地与EDTA溶液(-%(重))组合,进行,这类方法已熟知。在培养的毛囊细胞用于步骤(3)之前,如果需要,可除去肥大细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞。
在本发明方法的步骤(3)中,将培养的毛囊细胞植入受体区皮肤。已发现当将培养的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞直接植入受体区的毛孔内时,可获得非常好的效果,如果毛孔难以看见,尤其浅色皮肤,可通过在受体区皮肤应用一种通常是黄色的液体而使毛孔更易观测到,因毛孔内汗腺的汗液的分泌而使该液体在毛孔所在部位颜色变深,如此液体的一个例子是邻苯二醛在例如二甲苯或***中的1-10%溶液,,Nature,1967年1月28日,408页中所述。
优选地,将一定量的培养的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞的悬液导入每个毛孔中,所述的一定量含有足够量的能发育毛囊的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞,从中可生长毛发。毛囊形成所需的培养的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞的数量高度依赖于培养细胞的分化或生长潜力。当培养的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞具有相对高的分化程度时所需培养细胞的量比相对低的分化程度要少。有许多影响培养的毛囊细胞和/或自身(培养的)CD34+细胞分化程度的因素。例如所用培养基及培养时间是起作用的因素。优选地,使用在培养基中的培养的毛囊细胞和/或自身(培养)CD34+细胞的悬浮液。优选地,-5μl,-,如此少量的液体优选借助于配有中空针优选18-40G针的计量仪注入毛孔中。所用的计量仪可以是如吸量管的电子计量系统,在计量管或吸量管的末端装备有18-40G针。根据尤其是头皮毛孔的平均大小,优选使用中空34G针。但在身体其它部位更小或更大的针也可以使用。也可以并优选将悬液用(电子)重复注射仪如胰岛素笔进行注射。在此情况下,也可使用特别开发用于此目的的针,称作“毛囊引导针”(follicle-conductingneedle),在需要部位导入细胞且尽可能小地损伤皮肤。毛囊引导针是一柔韧的非常小的且毛囊细胞可随之而动的针。
在悬液注射期间,可同时导入使细胞生存更长时间的物质。这些物质如Minoxidil及其它生长刺激剂。
本发明还涉及一种从生长期毛发中培养毛囊细胞的方法,将一根或多根生长期毛发置入用一种适当的无血清角质细胞培养基和任选地用一种人肥大细胞系和/或自身(培养的)CD34+细胞或者一种或多种的人肥大细胞系和/或CD34+细胞的提取物和/或生长刺激剂补加的培养基中。如此培养基的获得方式在前面已描述。
关于所用培养基的各种组分及培养条件,其与上述方法的步骤(2)中应用的培养基与条件相同。因而优选使用一种肥大细胞系,其亚克隆和/或自身(培养的)CD34+细胞和/或生长刺激剂。合适的条件包括水饱和的且含3-10%(体积)CO2的环境、培养温度30-40℃。
本发明还涉及一种用于培养生长期毛发的毛囊细胞的培养基,及一种制备所述培养基的方法。本发明的培养基包括至少一种合适的无血清角质细胞培养基,任选地用一种人肥大细胞系和/或自身(培养的)CD34+细胞,或人肥大细胞系的提取物和/或自身(培养的)CD34+细胞的提取物,和/或生长刺激剂补加。如此培养基的特点尤其是含有源自一种或多种人肥大细胞系和/或自身(培养的)CD34+细胞的生长因子。
优选的培养基包括无血清角质细胞培养基及人肥大细胞系HMC-1或其衍生的细胞系如5C6或KU812的提取物或自身(培养的
)CD34+细胞的提取物。对本发明的培养基组分的详述在前已提供。
制备所述培养基的方法包括以下步骤(a)将至少一种肥大细胞系,其亚克隆和/或自身(培养的)CD34+细胞和/或生长刺激剂及任选地一种脱粒剂,其任选地与无机盐如CaCl2组合,加入无血清角质细胞培养基,(b)肥大细胞系、其亚克隆和/或自身(培养的)CD34+细胞被脱粒,从而生长因子释入培养基,(c)任选地从培养基中除去肥大细胞和/或自身(培养)CD34+细胞,如经离心进行,此后得到(条件)培养基。
根据本发明,从培养基除去肥大细胞和/或CD34+细胞和/或其残余物。
进行方法的条件不是特别关键的,且对本领域技术人员是显而易见的。步骤(a)中所用脱粒剂优选地是与CaCl2组合的化合物48/80。
最后,本发明涉及一种用于培养生长期毛发的毛囊细胞的前体培养基,该培养基包括至少一种合适的无血清角质细胞培养基,其任选地补加一种人肥大细胞系和/或自身(培养的)CD34+细胞,或一种或多种人肥大细胞系的提取物和/或CD34+细胞的提取物,和/或生长刺激剂,和/或至少一种脱粒剂。所述前体培养基可用作从中制备培养生长期毛发的毛囊细胞的合适的条件培养基。如果人肥大细胞系和/或自身(培养)CD34+细胞及脱粒剂均存在的话,可经脱粒而简单进行这种制备。如果二者缺一,即分别为肥大细胞和