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专利名称:***的制作方法
技术领域:
本发明涉及适于用作杀虫剂的***的分离和特性。
对具有抗昆虫,并且尤其是抗棉铃虫昆虫活性的***产生特殊兴趣的原因在于这类昆虫的重大经济学意义。新化合物的鉴定为发展另一类农业杀虫剂提供了基础。
随着昆虫对杀虫剂抗性的增强、人们对杀虫剂不利作用的认识以及逐渐对环境因素的更优先考虑,对取代现有化学性昆虫控制方法的要求也在日益明显。现有控制方法继后花费和所造成的损失使一些先前有利可图的农用工业变得毫无生气。
近来,人们对毒液尤其是蜘蛛毒及其所含***的药理和化学检测产生了新的兴趣。
基于一些蜘蛛毒液或者有关具有可逆作用的低分子量多******能够杀灭某些昆虫,一些作者1,2,3已提出了从蜘蛛毒中开发出杀虫剂物质的总体方案。
棉铃虫(Heliothisarmigera)是澳大利亚农用作物的主要害虫。棉铃虫是一种迁移性飞蛾,其幼虫以多种农作物为食。棉铃虫属具有世界性分布。美洲棉铃虫存在于从加拿大到乌拉圭的美洲大陆。与其非常相似的棉铃虫见于南部欧洲、非洲、近东、中东、远东、澳大利亚、新西兰和许多太平洋岛屿。在澳大利亚
,棉铃虫成灾并对棉花、烟草、马铃薯、绿豆、甜玉米、苜蓿、大豆、高梁、豌豆、亚麻子、红花、油菜子、向日葵和白羽扇豆造成严重损害。然而,基于对棉铃虫所付出的代价和因其造成的损失,棉花是目前上述这些作物中最为重要的受害作物。
本发明人从澳大利亚的漏斗网蜘蛛(funnel-webspiders)(Atrax和Hadronyche属)中分离出一同源系列的新型杀虫剂肽,它们具有相对低的分子量(.),并证明在将此类肽注射到棉铃虫标本中时不可逆的毒性。可以预见此类肽将对大量其它种类的昆虫显示出毒性。通过给诸如蝗虫、蟑螂、麻蝇和甲虫类害虫注射上述***已显示出其致死性或毒性。
本发明所分离并确定特性的***仅显示出与以前报道的昆虫活性***有限的相似性。例如,从Plectreurys种4中分离的昆虫特异性***是以相似的乙***浓度经层析洗脱分离的,它们是单链***,.,远大于本发明***。相反,,但随后的报道述及从上述昆虫中分离出了单链昆虫***18。据信它们是通过突触前钙通道阻断机制发挥作用的。
在所公开的资料中,来自Agelenopsis毒液6的μ-agatoxin
与本发明的***最为相似,它们具有相似的大小(36-38个残基,.),并且是单链***。
本发明的昆虫活性***是一组同源性***,完全不同于以前从澳大利亚漏斗网蜘蛛8,9中分离的哺乳动物***,因此预期本发明的***对哺乳动物系统没有生物活性。事实上,当分别将500pmol的In2***和400pmol的In3***注射到一只成年小鼠尾静脉中时未发现有任何活性,并且,已显示出V1对新生小鼠无毒性。
根据本发明的第一个实施方案,***,该***含有36-37个氨基酸残基,并能够形成3个链间二硫键,这种含二硫键的***对幼虫和/或成虫具有毒性,该毒性典型地是根据幼虫的异常运动和在通常时间不能化蛹以致最终死亡来证明的。
本文所定义的本发明***不包括在天然环境中存在的***。以适于测序形式分离的***一般纯度约为95%,尽管很显然该纯度级并非商业产品所必需的。
本发明包括羧酰***化和游离酸两种形式的***。
本发明的优选***为本文所定义的In1、In2、In3、MR1、V1、Fla和F1b。
本发明的***可从蜘蛛毒液中分离得到。
它们也可以用化学方法合成,或者通过重组技术从编码***或其前蛋白的分离之基因,或从合成基因的cDNA拷贝制得。
用重组技术制备本发明的***时,可通过构建编码本发明***之氨基酸顺序的DNA探针来制备***。
然后可用这些探针从蜘蛛细胞的DNA中分离编码***前蛋白的基因,或者从蜘蛛细胞mRNA制成cDNA,克隆到适宜的载体中以形成DNA库。这类DNA库可用标准技术制备。可用标准方法对分离的前蛋白基因测序,并且可将所说基因插入到例如适宜昆虫病毒(如杆状病毒)的基团组中,以使相应的***前蛋白在病毒对昆虫和/或其幼虫的感染过程中作为晚期蛋白得以表达。此外,还可以对植物细胞系进行基因工程化处理以使之表达***基因。***无关的蝎毒的澳大利亚专利申请46881/89中,教导了将***基因掺入到昆虫病毒或植物宿主中的合适方法。另外,合成的***基因能够用标准DNA合成技术构建,并最好利用有关昆虫病毒或植物基因密码子以及昆虫病毒或植物的共同起始顺序的知识,从而能将合成的***基因插入昆虫病毒或植物表达系统中。无论是从天然来源分离得到的,还是合成的编码本发明***的多核苷酸都包括在本发明的范围内。
重组蛋白的羧酰***化可在翻译后实现。
本发明进一步提供了经基因工程化加工以表达本发明***的昆虫病毒和植物品种。在典型的情况下,昆虫病毒和植物品种将表达没有其它漏斗网蜘蛛蛋白的本发明***。
本发明还提供了所说***的变异体,其中的一种变异体是对应于或包括本发明多肽***之一部分的多肽,,其含有36-37个残基,并能够形成3个链间二硫键,对昆虫和/或其幼虫具有毒性,并与本发明的***同源。为了便于描述,两个肽顺序间的“同源性”意味着相似但不完全相同,表明第一个顺序是从第二个顺序衍生的。尤其是如果将一多肽和本发明***的氨基酸顺序进行比较,显示出相同顺序达约70%以上时,该多肽即和本发明的***同源。这种顺序比较可通过已知的计算法进行,例如由Lipman和Pearson10所描述的计算法,它们很容易借助计算机完成。
根据本发明,可以通过常规的位点特异性诱变方法或化学合成方法生产同源性多肽,所说的诱变方法是一条常规鉴定能够被修饰而不使所产生的多肽丧失生物活性之分子残基的途径。
那些对应或包含本发明***的一部分但不与本发明***完全相同的变异体也包括在本发明范围内,它们是那些保持了***对于昆虫和/或其幼虫之毒性的分子。
这些变异体可经肽合成技术进行合成制备、重组制备或经裂解本发明的分离的***来制备。
可以按检测本发明***的方法检测本发明变异体的毒性。
编码本发明***之变异体的多核昔酸也包括在本发明范围内。可以对昆虫病毒和植物进行基因工程化加工处理,使之以类似于表达***本身的方式表达变异体,并且这些昆虫病毒和植物也构成本发明的一部分。
根据本发明的第二个实施方案,本发明提供了一种用于释放第一个实施方案中的***或***变异体的杀虫剂组合物。例如,当***或变异体可作为晚期蛋白由昆虫病毒表达时,可将编码***或变异体的病毒施用于希望被保护的作物。该病毒可配入农业上可接受载体、稀释剂和/或赋形剂中。适当的制剂包括那些农业配制剂中常规应用的制剂,并包括含水载体。该组合物按标准农业方法配制。适宜的病毒包括杆状病毒。
此外,可以对另外一种适当植物的作物本身进行基因工程化处理以使之表达***。
根据本发明的第三个实施方案,本发明提供了一种控制作物被害虫侵害的方法,该方法包括用第二个实施方案中的组合物处理作物或害虫和/或其幼虫。***或变异体可以以经工程化处理后能够表达作为晚期蛋白之***或变异体的昆虫病毒形式加以应用。可以用杀虫剂组合物处理害虫和/或其幼虫,例如,可用一种引诱剂将害虫吸引至组合物处。
另外,该方法可包括提供经工程化处理以表达***的作物或植物。可有效地应用该方法的作物包括棉花、烟草、马铃薯、绿豆、甜玉米、苜蓿、大豆、高梁、豌豆、亚麻子、红花、油菜子、向日葵和白羽扇豆。
图1显示雌性Atraxinfentus蜘蛛毒液的层析图。HPLC梯度如下流率1ml/分钟,0-24分钟内0-50%乙***,24-29分钟为50-60%乙***,29-34分钟为60-0%乙***。
图2显示雌性Hadronycheversutus蜘蛛毒液的层析图。HPLC梯度与
图1相同。
图3显示雄性Atraxrobustus蜘蛛毒液的色谱图。HPLC梯度与
图1相同。
图4显示粗MR1***重新分级分离后的层析图。HPLC梯度如下流率1ml/分钟,0-15分钟为20-35%乙***,15-20分钟为35-50%乙***,20-25分钟为50-60%乙***,25-28分钟为60-20%乙***。
图5显示通过气相测序获得的***In1、In2、In3、MR1和V1的氨基酸顺序。
附注1、划下线的残基也从金黄葡萄球菌V8蛋白酶消化物测序得到。
2、尽管结构以酰***化羧基末端表示,但有证据表明在这些***中羧基末端是游离酸。
3、MR1中最后的半胱氨酸残基是根据顺序同源性推测的。在测序过程中,前
5个这类残基是作为羧***衍生物检测的。
图6表示金黄葡萄球菌8白酶消化之In1、In2和In3的层析图。HPLC条件同
图1。
图7显示V1***对棉铃虫幼虫之有效剂量(50%)的概率单位评估。ED50=7μg/幼虫。
图8和图9显示对***F1初步分级分离的结果。图8显示蜘蛛毒的分级分离,图9显示粗F1的第二次分级分离。
图10显示重折叠In2的RP-HPLC分级分离。
图11显示In2A-COOH、In2A-CONH2和天然In2A的RP-HPLC结果。
图12显示In2A-COOH、In2A-CONH2和天然In2A的阳离子交换层析结果。
,其HPLC条件如下流率1ml/%TFA/%TFA/80%乙***检测210nm处紫外吸光率梯度02450%B50260%B60280%B8020%B
图14显示在下列HPLC条件下对粗F1第二次分级分离产生F1a和F1b
流率1ml/,%缓冲液A,80%乙***检测210nm紫外吸光率梯度17%B-24%B(0-8分钟
)
图15显示***Fla和Flb的气相测序结果。
图16显示本发明***间顺序的CLUSTAL比较。
图17显示漏斗网蜘蛛***与已公开的兴奋性***间的CLUSTAL比较。
图18显示漏斗网蜘蛛***与已公开的抑制性***间的CLUSTALA比较。
材料Atraxinfensus蜘蛛采集自Toowoomba,Queensland数公里范围内。其余的蜘蛛采自GreaterSydney地区。
通过将蜘蛛招引至攻击部位然后,从毒牙尖端收集所自发地排泄的毒液这一相当简单的方法对所有漏斗网蜘蛛进行拔毒。
将通过从活蜘蛛毒牙中直接吸取而收集的毒液置入硅烷化(Coatasil,AjaxChemicals,Australia)的玻璃吸移管中,并于-20℃下冻存备用。%三***乙酸(TFA)水溶液反复洗从吸移管吸回的毒液,然后冻干。乙***购自MallinckrodtAustralia,三***乙酸(TFA)和七***丁酸(HFBA)购自PierceChemicalCo.,二硫苏糖醇和4-乙烯吡啶购自SigmaChemicalCO.,内蛋白酶Glu-C(金黄葡萄球菌V8蛋白酶)购自ICNImmunobiologicals,CostaMesa,California,.,。所用的全部HPLC水由LiquipureModulabWaterSystem
生产,。
棉铃虫的培养用于蜘蛛毒液和毒液部分试验的棉铃虫标本保存于空调实验室中,。简而言之,将棉铃虫的成虫样本(每种性别各约15只)置于5升的容的环形的饲养仓内,其上部分衬以纸巾。在3-4天内,蛾进行了交配,并且雌性成虫产卵于纸巾上。%次***酸钠溶液中将纸巾轻柔搅拌5分钟以洗下虫卵。该步骤也具有对虫卵表面进行消毒的作用。
将虫卵收集到潮湿的棉纸中,然后放入-3升聚***乙烯袋内,直至1-2天后虫卵孵化为止。将所得的初龄幼虫转入单个30ml塑料杯中,每个杯内含有约10ml含青豆、麦芽、球拟酵母、抗坏血酸和山梨酸并以对羟苯甲酸M和甲醛作防腐剂的合成饲料。在25℃下经过约12天后,幼虫进入第六龄期,然后或者被用于蜘蛛毒/毒液馏分的试验,或者化蛹并最终形成新一代成虫。
毒液和其部分的生物检测尽管发现粗漏斗网蜘蛛毒液/毒液部分对棉铃虫样本的成虫和第六龄幼虫同样有效,但因为成虫在形成后的几天内将由于自然原因死亡,所以决定用终龄期幼虫完成所需的全部试验,而且,通过幼虫表现的异常运动和在通常时间内的化蛹失败来证实被验毒液或其部分的毒性。