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专利名称:母系诱导的动物不育的制作方法
母系诱导的动物不育相关申请的交叉引用本申请要求于2009年11月23日提交的美国临时申请号61/263,468的优先权,其公开的内容在此整体并入。对在联邦政府资助的研究与发展下做出的发明权利的声明本发明部分由美国科学和技术研究院先进技术项目(NIST-ATP)协议#70NANB3H3043和美国国家科学基金会SBIR基金#0912837的政府基金资助。发明背景存在对控制入侵物种和害虫例如鱼类、两栖动物、软体动物、甲壳类动物(crustaceans)和昆虫的技术的需要,该技术能替代用于大规模释放的辐射诱导的不育雄性。可靠的不育技术对基因工程的应用以使有益物种改进性状(例如,疾病抗性、改良生长或发育、杀虫剂抗性、破坏疾病传播机制)同样是有价值的。传统上,商业水产养殖中已通过三倍体诱导(增加一套额外的染色体)来产生不育的鱼类。然而,通常认为三倍性能对许多物种的性能产生负面影响,并且最优方案是物种依赖性的。该技术的应用劳动量大,而且难以保证100%的鱼是三倍体并因此是不育的。更简单的解决方案是用转基因或突变介导不育。已提议并测试了几种转基因方法来实现不育,但是时至今日,这些方法充其量是部分成功的。生理、细胞和分子水平上的不育尚未被证实(Thresheretal.(2009)Aquaculture290:104-09以及Wong&vanEenennaam(2008)Aquaculture275:1-12)
。主要障碍在于需要暂时逆转不育以繁殖品系。期望的是不需要在每一代都重复处理的解决方案。以开发转基因不育鱼为目的的大部分研究集中于使参与性腺生长、分化和成熟的激素失活的方法。所推荐的激素靶标包括促性腺激素释放激素、卵泡刺激素和促黄体激素。这些关键基因的沉默原则上应能导致性不成熟和不育的鱼类,其生育力可通过外源递送缺失的激素来挽救。虽然理论上是巧妙的,但是该方法中存在许多固有的困难。首要问题是在一些鱼类基因组中存在多种激素基因家族成员。此外,这些激素具有生育力以外的生物功能。最后,在依赖于敲低技术的模型中,不育并非100%,并且生育力的降低在性别和建群系之间不同。沉默内源性生殖基因的备选方法是产生具有这样的基因的转基因系,该基因经设计能破坏早期胚胎发育模式形成中关键的信号转导通路,致使胚胎死亡。该方法利用基因敲低技术如反义RNA和dsRNA,或者利用成形基因的错误表达。将这些胚胎破坏物置于胚胎特异性启动子的控制下,所述胚胎特异性启动子在胚胎发育过程中表达。为实现可逆性并允许品系繁殖,将构建体设计为使细菌阻抑系统置于启动子和关键发育基因破坏物之间。该系统利用商购的Tet-响应PhCMV*_ll启动子。理论上,如果胚胎发育过程中短时间施加药物(如四环素或其衍生物)阻断破坏物基因的表达并提供对繁殖的可逆控制,则鱼类可圈养繁殖。至今,已证明致力于产生不育系不能成功。难
以形成这些品系可能是由于Tet响应启动子易泄露,导致胚胎破坏物基因的低水平表达以及随后对建群系产生的选择。所述系统还需要使用细菌基因和启动子系统,这使商业化的管理审查过程变得复杂。该方法的其他缺点是需要使用四环素(或其衍生物),这将增加生产成本并产生环境危害。本发明克服了以前方法的许多缺点。本发明提供了能够使不同种类的脊椎动物和无脊椎动物有效绝育的转基因技术平台。另外,转基因系可易于繁殖而无需使用有潜在毒性或有害的物质。本技术可使有益物种的商业生产利润更高且在环境方面更有利。例如,养殖的水生物种的绝育将1)防止基因流向野生种群以及养殖的非本地物种在新的生境建群(生物限制);2)用改进的遗传学保护有价值的品系;3)通过减少性腺发育和性别分化消耗的能量或者通过允许产生全雄性种群而提高性能。如果物种的雄性比雌性生长更迅速,则全雄性种群是有利的。基本100%有效的绝育方法将使转基因技术的开发具有降低的风险,并且有显著改善目前限制技术的前景因而,本发明提供明显的优势,包括(i)100%的有效性;(ii)相对其他方法更低的成本(无需劳动力或处理以使品系繁殖或绝育)所表达的基因产物不会负面影响宿主性能或不需要使用具有潜在的健康或环境风险的有毒基因或试剂;(vi)该策略在不同生物中应用广泛;(Vii)利用同一构建体的靶物种范围广;以及
(Viii)转基因系易于繁殖。发明简述本发明提供了用于产生转基因谱系终结雌性的组合物和方法,所述谱系终结雌性将产生不育子代。还提供了使用转基因雄性繁殖转基因系的组合物和方法。在一些实施方案中,本发明提供了母系不育构建体(MSC),即表达构建体,其包含(i)MSC启动子;(ii)能够消除原始生殖细胞(PGC)的多核苷酸序列;以及(iii)至少一种生殖细胞特异性顺式作用元件,其中将和(iii)可操作地连接。在一些实施方案中,MSC启动子是母系启动子,例如来自askopos(kop)或zonapellucida(zpc)基因的启动子。在一些实施方案中,生殖细胞特异性顺式作用元件包含生殖系基因的3’UTR序列,例如来自dead-end(dnd)或nanos(nos)基因的3,UTR序列。在一些实施方案中,能够消除PGC的多核苷酸序列是促凋亡序列。在一些实施方案中,促凋亡序列直接起作用使PGC凋亡,并且编码促凋亡蛋白,如Bax、Bak、Bok、Bad、Bik、Puma、Noxa或效应半胱天冬酶(caspase)。在一些实施方案中,促凋亡序列间接起作用,例如通过减少抗凋亡基因例如bcl-2、bcl-xl、bcl-w的表达。在一些实施方案中,促凋亡序列通过减少PGC的正确迁移或特化所必需的基因例如CXCR4-0、胰岛素样受体lb、foxCl或nanos的表达而间接起作用。在一些实施方案中,本发明提供了携带上文所述的MSC转基因的转基因动物。在一些实施方案中,MSC转基因动物是谱系终结雌性。在一些实施方案中,
MSC转基因动物选自鱼类、软体动物、甲壳类动物、两栖动物、昆虫和节肢动物。在一些实施方案中,MSC转基因动物携带至少一种额外的转基因。在一些实施方案中,本发明提供了产生谱系终结雌性的方法,所述方法包括以下步骤(i)将MSC导入动物祖细胞(例如胚胎细胞),以产生在其生殖细胞中携带MSC的MSC转基因建群动物;(ii)培育步骤(i)的MSC转基因建群动物,以产生半合子MSC转基因雄性;(iii)使MSC转基因雄性与无MSC的雌性交配;以及(iv)选择步骤(iii)的MSC转基因雌性子代,以得到谱系终结雌性。在一些实施方案中,所述方法还包括使步骤(iv)的谱系终结雌性与雄性杂交,以产生不育子代的步骤。在一些实施方案中,谱系终结雌性携带至少一种额外的转基因。在一些实施方案中,本发明提供了产生不育的一代动物的方法,其包括使谱系终结雌性与雄性杂交,以产生不育子代。在一些实施方案中,不育子代携带至少一种额外的转基因。在一些实施方案中,尽管全部子代都是不育的,但谱系终结雌性只有一半的子代遗传了MSC转基因(图I)。因为非转基因但不育动物的种群是有价值的,所以在一些实施方案中,所述方法还包括检测MSC转基因的存在并将MSC转基因不育子代和非MSC转基因的不育子代分离。在一些实施方案中,使用荧光标志物或颜色标志物来检测MSC转基因(例如通过将额外的编码标志物的序列添加到
MSC转基因中)。在一些实施方案中,通过MSC转基因不育子代的死亡来检测MSC转基因(例如通过在条件或发育阶段特异性启动子控制下,将致死编码序列添加到MSC转基因中)。在一些实施方案中,本发明提供了使MSC转基因动物繁殖的方法,其包括(i)将MSC导入动物祖细胞中,以产生在其生殖细胞中携带MSC的MSC转基因建群动物;(ii)培育步骤⑴的MSC转基因建群动物,以产生半合子MSC转基因雄性;(iii)使MSC转基因雄性与无MSC的雌性交配;以及(iv)选择步骤(iii)的MSC转基因雄性子代,以培育并繁殖出另一代MSC转基因动物。附图
简述图I:描述产生不育动物并繁殖MSC转基因系的实例流程2:来自携带转基因的转基因雌性的活胚胎的PGC的早期标记。(A)ask0p0seGFP-dnd3’UTR;或(B)zpc:eGFP_dnd3’UTR。由转基因雌性与野生雄性杂交得到的胚胎。在椭圆形阶段之前,GFP均匀分布于胚盘(A和B1-2)中。可区分生殖细胞与体细胞的最早时间点是在早期原肠胚形成过程中(受精后4小时,A2和B2)。A3,B3:处于晚期体质形成的胚胎,以及A4,B4:受:精后30-48小时(hpf)的胚胎。图3:转基因雌性的荧光显微镜图像。(A)I个月大的雌性的侧视图(zpceGFP-dnd3’UTR)显示GFP性腺穿过体壁。⑶和(C)3个月大的雌性的解剖卵巢(askoposeGFP-dnd3'UTR),其中在卵母细胞I期和II期观察到GFP表达最强。图4Bax介导的
PGC消除。(A)描述用于表达合成的带帽baxdndmRNA的Litmus28ibax:dnd3’UTR构建体。(B)琼脂糖凝胶上显现(A)的Bax:dndmRNA。(C)促凋亡斑马鱼Bax以剂量依赖的方式诱导死亡。(D-G)24-hpf胚胎(D和F)和48_hpf胚胎(E和G)的荧光图像。(D和E)给出模仿注射的胚胎(对照组)。(F和G)给出用合成的baxdnd3’UTRmRNA注射的胚胎(测试组)。(H-J)测试组胚胎中早期体节发生过程中PGC集簇的慢速拍摄画面(Time-lapseframe)。注意GFP在细胞边缘扩散,表明为凋亡小体特有的胞膜起泡⑶和随后的分离成小的细胞碎片(I,J)。⑷基于对照组和测试组的20个胚胎的分析的性别比。(L)3个月大的对照注射胚胎的解剖性腺。(M)bax:dnd3’UTRRNA注射的胚胎的解剖性腺。图5(A)MSCzpc和MSCkop构建体的不意图。通过qRT-PCR使用bax和dnd之间的连接处的PCR来鉴定转基因的鱼。(B)从不同的雄性建群者(粗体)建立的转基因MSC谱系图。竖线代表单独对MSC转基因为阳性(黑色)或者对MSC和GFP转基因均为阳性(绿色复纵线)的Fl子代基因型。Fl子代的表型性别和数量如以下所示雄性(ml,m2,m3...)和雌性(f1,f2,f3...)。显示来自不同Fl系的F2雄性子代的百分比和F2后代的总数(n)。选择图中圈出的Fl雌性子代来研究母系遗传的转基因对PGC的影响(表达GFP)。(Cl)Fl雌性MSCzpc3的胚胎中的PGC显示经历凋亡的细胞的特征胞膜起泡(GFP在细胞边缘扩散)
和形成凋亡小体(由箭头显示)。(C2)吖啶橙处理的源自Fl雌性MSCzpcll(fI)的胚胎的荧光显微镜图。(D)显示PGC可变缺陷的Fl雌性(f2)MSCzpc3的24hpf和48hpf胚胎的突光图。48hpf时,A组中的胚胎显示正常的PGC计数,而B组显示PGC数量减少及C组没有可见的PGC。(E)不同MSC系的子代中GFP标记的PGC的平均数量。源自MSC雌性(左)的胚胎显示PGC显著减少(高达90%),而源自MSC雄性(右)的胚胎显示正常的PGC数量。将大约20个胚胎用于计算所测试的每一转基因系的PGC的平均数量。竖线代表标准差。图6:雄鱼性腺的外观。(A)不育(MSCzpc22)的鱼和(B)来自具有0-3个PGC的MSCzp3组的低受精率的鱼仅在一侧显示正常性腺而非正常的一对。(C-N)用苏木精和伊红(H&E)染色的性腺组织学切片。(C)不育,(D)野生型,及(E)萎缩性腺的横切片。组织由基底膜围绕的细管组成。细管内,在野生型鱼中可看到高密度的精子(S),部分可育鱼中可看到低密度的精子(S),而在不育个体的小叶腔中未检测到精子。塞尔托利细胞(Sertolicell)存在于细管内,而莱迪希细胞(Leydigcell)存在于胞间隙。(F-N)FlMSCzpc9雄性(F)和同胞雌性(I,L),F1MSCzpc22雄性(G)和同胞雌性(J,M)以及FlMSCkop2雄性⑶和同胞雌性(K,N)的年龄匹配的F2不育和可育子代的纵切图。图7:评估不育表型(A)消除成体生殖细胞的性腺(解剖自MSCzpc22系的F2不育鱼)显示出以与野生型精巢相似的水平表达雄性特异性标志物
sox9a。相反地,我们并未检测到卵巢滤泡标志物cypl9ala的表达。每一实验进行一式三份。(B和C)成体生殖系缺陷的性腺未显示生殖细胞特异性标志物vasa的表达。(B)解剖自4条野生型鱼(2条雄性和2条雌性)和3条不育鱼的性腺组织的sox9a和vasa基因的RT-PCR分析。泳道I显示无逆转录酶(无RT)的阴性对照。(C)对解剖自6条不育雄性、5条生育力降低的雄性以及野生型雄性和雌性对照的性腺进行Q-RT-PCR分析。我们使用管家基因P-肌动蛋白来校正样品之间的RNA水平。来自不育鱼的样品未检测到vasa表达。来自生育率降低的的鱼的性腺的vasa表达的相对水平低于野生雄性和雌性的60-90%。(D)FlMSCzpc9、MSCzpc22和MSCkop2雌性的子代的受精率。红色柱(上部,有的话)指示受精卵的数量,蓝色柱显示未受精的卵。图8:(Al和A2)将GFP报告基因构建体融合到斑马鱼dnd3’UTR和nanos3’UTR。(Z1-4)用60pg合成的带帽RNAeGFPdnd(Z120hpf-Z224hpf)和eGFPnosl3,UTR(Z34hpf,Z448hpf)注射的斑马鱼胚胎的荧光图像。(T1-4)受精时用200pg合成的带帽RNAeGFP:dnd(Tl,T2)和eGFP:nosl(T3,T4)注射的30天大的鳟鱼胚胎。(S1,S2)用200pg带帽RNAeGFPnosl注射的20天大的鲑鱼胚胎**。箭头指示显示相对于消化道(DT)的背侧位置的GFP-PGC显示自发荧光。给出30天大的眼点期的鳟鱼胚胎*和20天大的去卵黄的鲑鱼胚胎
**的侧视图。随着胚胎的发育,体细胞显示减弱的荧光,而PGC中观测到持续且加强的GFP。(Cl)驱动融合到斑马鱼nosl3’UTR的大西洋鲑(Salmosalar)bax的表达载体。(C2)24hpf和48hpf时,GFP同窝雌性对照的斑马鱼胚胎(模仿注射)或用IOpg合成的带帽RNAssbaxnosl注射的斑马鱼胚胎的荧光图像。(C3)24和48hpf(n=8)时,对照(蓝色柱,右)和ssbax:nosl(红色柱,左)注射的斑马鱼胚胎中PGC的平均数量。竖线代表标准差。发明详述I引言本发明提供了以经济有效的方式产生不育动物的组合物和方法。所述技术利用空间特异和时间特异地递送能够消除发育胚胎中的原始生殖细胞(PGC)的转基因产物。没有生殖细胞,胚胎长成不育动物。诱导不育的转基因是需要三种元件的母系不育构建体(MSC):驱动能消除PGC的多核苷酸序列的MSC启动子,融合到生殖细胞特异的顺式调控元件(如3’UTR)。无论父本是否携带MSC转基因,存在MSC转基因的雌性都将使其子代不育。MSC转基因雄性可与野生型雌性杂交以繁殖品系,并且这些子代并不是不育的。图I说明MSC转基因如何保持或用于产生不育动物。步骤I中,将转基因导入祖细胞(如胚胎干细胞)以产生MSC转基因建群动物。使生殖系能遗传MSC转基因的建群动物与MSC阴性动物杂交,以产生MSC转基因动物的Fl代(步骤2)。后代中转基因的存在可根据标准方法(例如PCR或将编码容易显现性状的基因添加到