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专利名称:欧洲型舞毒蛾的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针的制作方法
技术领域:
本发明涉及林业和植物检疫技术领域,具体涉及一种欧洲型舞毒蛾的检测方法;尤其涉及一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法;此外,本发明还涉及检测欧洲型舞毒蛾的引物和探针。
背景技术:
舞毒蛾Lymantriadispar(Linnaeus)属鱗翅目(Lepidoptera)、毒蛾科(Lymantriidae)、毒蛾属(Lymantria),是世界公认的全北温带地区森林和观赏性林木害虫。舞毒蛾幼虫寄主范围广,主要有杨、柳、榆、栎、落叶松、椴、云杉等树木。主要分布在欧洲、北美、中国、日本、朝鲜,根据其形态特征、生物学****性和地理分布,舞毒蛾被分为亚洲亚种()、欧洲亚种((Linnaeus))和日本亚种((Motschulsky))。亚洲亚种和日本亚种被统称为亚洲型舞毒蛾,其中亚洲亚种在我国有分布,欧洲亚种则被称为欧洲型舞毒蛾。亚洲型舞毒蛾主要分布在亚洲和部分欧洲地区,雌成虫飞行能力强,可为害约500种寄主植物。欧洲型舞毒蛾原产欧洲,于
1869年由欧洲传入美国,雌成虫不能飞行,为害约250种寄主植物。欧洲型舞毒蛾在欧洲为害严重,分布广泛,1948年Cointat就描述了舞毒蛾在法国普罗旺斯地区的大爆发,1962年Kailidis报道了舞毒蛾在希腊的危害,1972年Keremidchiev报道了舞毒蛾在保加利亚的危害等。舞毒蛾在亚洲和欧洲的危害历史久远,近年普遍受到关注的原因是欧洲型和亚洲型舞毒蛾先后被引入了北美,美加持续关注。舞毒蛾最先被引入北美是由一次人为意外。,由于在实验室饲养时部分成虫逃逸,10年后舞毒蛾在Trouvelot家的周围大爆发。1890年美国政府和州政府开始了采取喷药进行根除舞毒蛾的行动,但是,由于无法根除彻底而导致行动失败。从那以后,舞毒蛾以每年69km的速度向美国的西南方向蔓延。现在,欧洲型舞毒蛾在北美的分布包括了美国的东北方以及东南和中西部的部分地区,受危害的林木面积达200万hm2,还有加拿大东部的部分地区。由于舞毒蛾的检疫重要性,因此,寻求快速、准确的欧洲型舞毒蛾的检测鉴定方法是现阶段检疫技术亟待解决的问题和发展的方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法;为此,本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用欧洲型舞毒蛾检测引物及探针可以快速、准确地对欧洲型舞毒蛾进行检测鉴定。本发明根据亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾这几个地理种群的
mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物和探针,建立了欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法,以达到快速准确检测鉴定欧洲型舞毒蛾的目的。
在本发明的一方面,提供一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法,包括如下步骤(I)设计引物和探针;该引物的序列为上游引物EU-F:5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’();下游引物EU-R:5,-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3,();该探针的序列为欧洲型舞毒蛾探针EU-MGBFTGGATCTCCTCCTCCTP()或其互补链;(2)提取欧洲型舞毒蛾DNA;(3)采用步骤⑴设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。步骤⑵具体为取欧洲型舞毒蛾单头虫样放入研钵,加液氮磨成粉末状,用试剂盒提取样品DNA。步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应体系为25iiL,包括2XPremixExTaq
,,步骤(I)设计的上下游引物EU-F/,EU-,,超纯水补至25uL。步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应程序为预变性95°C30seC;然后95°C5sec,65°C34sec循环40次。在本发明的另一方面,提供一种用于检测欧洲型舞毒蛾的引物,其序列为上游引物
EU-F:5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’();下游引物EU-R:5,-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3,()。在本发明的另一方面,提供一种用于检测欧洲型舞毒蛾的探针,其序列为EU-MGBFTGGATCTCCTCCTCCTP()或其互补链。上述实时荧光PCR检测方法采用MGB(全称为MinorGrooveBinder)探针。MGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子,以取代常规可发光的TAMRA荧光标记;二是探针的3’端另结合了Minorgroovebinder结合物,使探针的Tm值提高,大大增加了探针的杂交稳定性。该方法具有如下优点1、更容易设计;2、探针更短3、提高配对与司E配对模板间的Tm值差异;4、实验结果更精确、分辩率更高;5、杂交的稳定性提高;
6、低背景;7、重复性更强。该方法适合病原体的检测、SNP和突变体检测,既可以进行基因定量分析,又可以进行基因突变分析。与现有技术相比,本发明的有益效果在于I、检测时间大大缩短,可以在六个小时内完成检测,传统的常规方法需10-20天;2、对欧洲型舞毒蛾的鉴定准确率增大,传统的常规方法还需要其他详细产地等信息支持才能鉴定。
图I是本发明的引物EU-F/EU-R和探针EU-MGB在欧洲型舞毒蛾上的位置示意图;图2是亚洲型、欧洲型、北美型舞毒蛾序列在探针位置的比对示意图;图3是不同来源的5个舞毒蛾样品实时荧光
PCR扩增的结果示意图;图4是不同来源的20个舞毒蛾样品实时荧光PCR扩增的结果示意图5是不同稀释浓度的欧洲型舞毒蛾样品实时荧光PCR扩增的结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述条件,或按制造厂商所建议的条件。(线粒体DNA)中部分基因的序列设计如下特异性引物EU-F/R和探针EU-MGB(引物和探针由上海基康公司合成)欧洲型舞毒蛾引物上游引物EU-F:5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’();下游引物EU-R:5,-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3,();欧洲型舞毒蛾探针EU-MGB:FTGGATCTCCTCCTCCTP()或其互补链。上述引物及探针的检测原理如图I所示,3种不同类型舞毒蛾序列在探针位置的比对见图2。2、提取舞毒蛾DNA取舞毒蛾单头虫样(样品来源见表I)放入研钵,加液氮磨成粉末状,用DNeasyBlood&TissueKitt(Qiagen公司)提取样品DNA。表I舞毒蛾样品信息
权利要求
,其特征在于,包括如下步骤(1)设计引物和探针;该引物的序列为上游引物EU-F:5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’();下游引物EU-R:5,-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3,();该探针的序列为欧洲型舞毒蛾探针EU-MGBFTGGATCTCCTCCTCCTP()或其互补链;(2)提取欧洲型舞毒蛾DNA;(3)采用步骤(I)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。
,其特征在于,步骤⑵具体为取欧洲型舞毒蛾单头虫样放入研钵,加液氮磨成粉末状,用试剂盒提取样品DNA。
,其特征在于,步骤⑶中,所述实时荧光PCR检测的反应体系为25iiL,,,步骤(I)设计的上下游引物EU-F/,EU-,,超纯水补至25uL。
,其特征在于,步骤(3)中,所述实时荧光PCR检测的反应程序为预变性95°C30seC;然后95°C5sec,65°C34sec循环40次。
,其特征在于,其序列为上游引物EU-F:5’-AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’();下游引物EU-R:5,-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3,()。
,其特征在于,其序列为EU-MGBFTGGATCTCCTCCTCCTP()或其互补链。
全文摘要
本发明公开了一种欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针,根据亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾这几个地理种群的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物EU-F/R和探针EU-MGB,建立了欧洲型舞毒蛾的实时荧光PCR检测方法,以达到快速准确检测鉴定欧洲型舞毒蛾的目的。