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专利名称:橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法
技术领域:
本发明涉及一种植物组织培养方法,具体涉及一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤
诱导及再生体胚植株的方法。
背景技术:
巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)属橡胶树属大戟科,是热区广泛种植的重要经济作物,因其胶乳产量高、质量好、易于获取而具有商业开发价值,成为世界上天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是多年生乔木,常规育种周期长,选育种受到很大的限制。为了拓宽巴西橡胶树育种途径,改良其品质,从上个世纪50年代以来,橡胶育种学家们即开始着手研究其组织培养技术,特别是上个世纪70年代以来,我国、马来西亚、法国、印度、印度尼西亚、斯里兰卡等国投入大量的人力、物力、财力对这项技术进行广泛的研究,目前在花药培养、未授粉胚珠和子房培养、茎尖及嫩茎培养、悬浮细胞培养、原生质体培养、体细胞植株的克隆增殖和遗传转化等方面都取得了一定的进展。花药和内珠被培养是巴西橡胶树组织培养中研究较早和较多的方向,其基本过程是1)拨取橡胶处于单核晚期的雄花花药或切取幼嫩橡胶树种子的内珠被进行脱分化培养,约3060天;2)将形成的脱分化愈伤转入橡胶胚诱导培养基,进行胚诱导培养过程,约
34个月;3)经胚诱导过程后,会从部分脱分化愈伤上形成胚性愈伤,胚性愈伤经进一步发育会逐步形成棒状、心形、鱼雷形胚(以上为成熟胚)等,这些都是胚性组织;4)将成熟胚依次转入芽诱导和根诱导培养基内进行芽和根的培养,当长到适宜高度后再转入自然环境锻炼和定植。迄今,我国花药和内珠被植株的大田栽培面积已有近千亩,与传统的芽接苗相比,花药和内珠被植株植株具有生长速度快、干胶产量高、抗逆性强的特点,未来可能成为主要的种植材料。目前,花药和内珠被植株培养中存在的主要问题是外植体取材受橡胶开花和结果时间的限制,脱分化愈伤成胚率低且难以长期继代保存,因而植株再生频率低,生产成本高,后期靠体胚植株茎段微繁技术也很难满足生产中对组培苗的大量需求和建立高效遗传转化体系等生物技术实验的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生方法,它是选择适宜的子叶胚进行切片处理诱导高效的胚性愈伤,由胚性愈伤再诱导出大量子叶胚,并成苗的过程,该方法能大量长期继代增殖保存良好的胚性材料,大大提高了橡胶树的组织培养效率,为生产和实验提供了良好的再生体系方法。
本发明所采用的技术方案—种橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法,包括胚性组织的选取与处理过程、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程、高效胚性愈伤诱导成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程。
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1、胚性组织的选取与处理过程在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上,选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康,长lcm以上的子叶胚为外植体,进行切片处理,切成宽23mm、长35mm的米粒状切片。切片的质量影响愈伤诱导效率,切片过小,难以诱导出愈伤,切片太大浪费材料的同时也难诱导出理想的愈伤。
2、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程将米粒状子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上于2628t:进行暗培养2040天。其中2030天的愈伤出胚效率最高,体胚愈伤在胚诱导培养基上培养45天后观察,出胚愈伤率可达4060%,出胚率可达200300%,20天以前的愈伤量很少,40天以后的愈伤出胚效率明显降低,都不宜选择为胚诱导的愈伤材料。所述胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基,,4-D、、0l卯mBA、02卯mNAA、02卯mZT、蔗糖7090g/L、椰子水50ml/L、***。3、高效胚性愈伤诱导成胚过程将步骤2得到的脱分化愈伤接到胚诱导培养基上于2426t:进行暗培养。2030天可观察到体胚的发育过程,
4060天时能大量形成子叶胚。这些子叶胚长到lcm以上时便可进一步切片诱导高效胚性愈伤进行体胚的循环增殖,或者接入成苗培养基内诱导形成自根苗。所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基,其中大量元素减少1050%,,、、、、、水解酪氨酸50300mg/l、、麦芽糖020g/L、蔗糖5070g/L和椰子水50ml/L。
4、成熟胚的选取与诱导成苗过程选取步骤3诱导产生的健康、完整、(TC进行光培养。约IO天子叶胚可抽出健状的主根,约20天子叶胚可抽出10cm的健状茎段。所述自根苗培养基是以MS培养基为基础培养基,其中大量元素减少1030%,并添加02卯mBA、、、、糖3050g/L和椰子水50ml/L。
本发明的优点1、子叶胚诱导率低是橡胶树组培中存在的主要问题,也是制约橡胶树体细胞植株工厂化生产的瓶颈,利用子叶胚高效胚性愈伤诱导出胚,可大大提高形成子叶胚的效率,解决了橡胶树成胚率低和自根苗成苗率低的问题。橡胶的成胚过程,从大的方面需要经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚四个阶段,实验中发明人发现子叶胚以外的白色胚性组织包括畸形胚也能切片诱导出具有较高胚诱导效率的愈伤组织,但这些胚性组织诱导出的胚,胚性不稳定,产生畸形胚的比率很高;同时,子叶胚以前阶段的白色胚性组织个体较小,胚状体难以切片,并且浪费材料,因而不宜选择为外植体切片材料。子叶胚切片容易、切片均匀,诱导出的愈伤出胚效率高,并且几乎没有畸
形胚的出现,能很好的保存形成子叶胚的能力,子叶胚成熟后进一步诱导成苗率可达80%以上。2、花药或内珠被接种费工、费钱,还受花期、果期及气候等自然条件的极大限制,利用子叶胚切片诱导愈伤进行增殖可以弥补以上不足,长期保存健康的可利用组培材料,提高实验和生产效率。3、传统的橡胶树组织培养从花药或内珠被接种到诱导出成熟的子叶胚一般需要150天,而本发明只需要100天就可得到成熟的子叶胚,大大縮短了成胚时间,提高了组织
培养效率。
4、胚性组织成功继代增殖为橡胶转化技术提供了新的技术路线。从1994年Arokiaraj等利用基因枪法枪轰击巴西橡胶花药脱分化愈伤组织获得了第一株转基因橡胶植株以来,利用花药或内珠被脱分化愈伤进行转化成了巴西橡胶转化的基本技术路线。这类转化路线实现转化过程长,仅从脱分化愈伤诱导成胚就需34个月,特别是农杆菌转化的抑菌、筛选过程中长期使用大量抗生素,对愈伤的生长、胚性组织的诱导等产生较大的不良影响,这些因素造成了转化后的愈伤成胚率极底。然而,子叶胚高效胚性愈伤出胚率高,
初步农杆菌转化实验证明其抗转化作用强,转化后仍能较快成胚。因此,为橡胶转化体系的建立开创了展新的技术路线。在橡胶树花药组培或内珠被组培的基础上,本发明工艺流程简单,生产成本低,子叶胚增殖率高,组织培养周期短,具有很大的应用价值。
图1是本发明的愈伤诱导天数与出胚愈伤数的关系图。
图2是本发明的愈伤诱导天数与出胚率的关系图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上,选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程3个月产生的新鲜、健康,长13cm以上的子叶胚为外植体,在超净工作台上进行切片处理,先纵切再横切成宽23mm、长35mm的米粒状小切片。
2、将子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上培养,用9cm的培养皿,每个培养皿接1015个切片,切片均匀放置,培养室温度保持在2628t:,暗培养。实验表明愈伤诱导天数与出胚愈伤数和出胚率呈线性关系(见图1、图2),其中2030天的愈伤出胚效率较高,应选择为诱导出胚的愈伤材料,20天以前的切片愈伤量很少,40天以后的愈伤出胚效率明显降低都不宜选择为诱导出胚的愈伤材料。3、将在体细胞胚高效胚性愈伤诱导培养基上培养
25天的脱分化愈伤接到高效胚诱导培养基上于2426t:进行暗培养,20天左右就可观察到体胚的发育过程,4060天时能大量形成子叶胚,45天时统计出胚情况,%,%。4、选取步骤3经体胚诱导过程产生的健康、完整、,约10天子叶胚可抽出健状的主根,约20天子叶胚可抽出10cm的健状茎段。培养室温度保持在283(TC,光培养,每天12小时光照。
权利要求
一种橡胶树子叶胚高效胚性愈伤诱导及再生方法,其特征在于包括胚性组织的选取与处理过程、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程、高效胚性愈伤诱导成胚过程、成熟胚的选取与诱导成苗过程;1)、胚性组织的选取与处理过程在橡胶树花药或内珠被组织培养的基础上,选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程产生的新鲜、健康,长1cm以上的子叶胚为外植体,进行切片处理,切成宽2~3mm、长3~5mm的米粒状切片;2)、体细胞胚高效胚性愈伤的诱导过程将米粒状子叶胚切片接种到胚性愈伤诱导培养基上于26~28℃进行暗培养20~40天;所述胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基,~2ppm2,4-D、~2ppmKT、0~1ppmBA、0~2ppmNAA、0~2ppmZT、蔗糖70~90g/L、椰子水
50ml/L、~2g/L天门冬酰***~;3)、高效胚性愈伤诱导成胚过程将步骤2得到的脱分化愈伤接到胚诱导培养基上于24~26℃进行暗培养;所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基,其中大量元素减少10~50%,~2倍,~3ppmBA、~3ppmKT、0~、~1ppmGA、0~.5ppmABA、水解酪氨酸50~300mg/L、~、麦芽糖0~20g/L、蔗糖50~70g/L和椰子水50ml/L;4)、成熟胚的选取与诱导成苗过程选取步骤3诱导产生的健康、完整、~30℃进行光培养;所述自根苗培养基是以MS培养基为基础培养基,其中大量元素减少10~30%,并添加0~2ppmBA、~2ppmKT、~1ppmNAA、~、糖30~50g/L和椰子水50m1/L。
,其特征在于步骤3所得的子叶胚长到lcm以上时可再切片进行诱导产生胚性愈伤进行体胚的循环增殖,或者接入成苗培养基内诱导形成自根苗。
全文摘要
本发明涉及一种橡胶树体细胞胚高效胚性愈伤诱导及再生体胚植株的方法,是选择花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导产生的子叶胚为外植体,进行切片处理,然后将切片接种到胚性愈伤诱导培养基上进行暗培养得到脱分化愈伤;将脱分化愈伤接到胚诱导培养基上进行暗培养产生的子叶胚;将子叶胚接到自根苗培养基上进行光培养。本发明在橡胶树花药组培或内珠被组培的基础上利用子叶胚高效胚性愈伤诱
导出胚,可大大提高形成子叶胚的效率,而且不受花期、果期及气候等自然条件的制约,具有工艺简单,生产成本低,子叶胚增殖率高,组织培养周期短等特点,具有很大的应用价值,也为橡胶转化体系的建立开创了展新的技术路线。