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植物耐逆性相关蛋白TaPK及其编码基因和应用的制作方法
本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaPK及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质,是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明发现的基因TaPK在低温、高盐和高温的诱导下表达,且将TaPK基因导入拟南芥中得到的转基因拟南芥,其对以上三种逆境的抗性高于野生型拟南芥,本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础,将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。
【专利说明】植物耐逆性相关蛋白TaPK及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】,尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaPK及其编码基因和应用。【背景技术】
[0002]干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此,了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制,提高小麦品种的抗逆性,成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。
[0003]在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应,伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制,将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前,植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平,并与遗传学和遗传工程研究相结合,探索用生物技术来改进植物生长特性,其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004]在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下,植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整,以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达,这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答,而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径,从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类:第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物;第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子,如蛋白激酶、转录因子等。其中,蛋白激酶在植物胁迫信号的感知、传递的调控中起着重要作用。
[0005]到目前为止,已发现的蛋白激酶约有300种左右,分子内都存在一个同源的由约270氨基酸残基构成的催化结构区。在细胞信号传导、细胞周期调控等系统中,蛋白激酶形成了纵
横交错的网络。这类酶催化从ATP转移出磷酸并共价结合到特定蛋白质分子中某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上,从而改变蛋白质、酶的构象和活性。
[0006]目前,在植物中已知的与胁迫相关的蛋白激酶主要有:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶如MAPK(mitogen-activatedproteinkinase),CDPK(calcium-dependentproteinkinase);酪氨酸蛋白激酶如Src家族、Tec家族、ZAP70、家族、JAK家族;还有一种丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸双特异性蛋白激酶,如DYRK相关的蛋白激酶,CDC25等。这三类蛋白激酶均有文献报道参与植物相应外界环境胁迫的信号传导过程,提高植物对外界逆境的适应能力。
[0007]根据蛋白激酶的磷酸化氨基酸残基的种类,蛋白激酶可以分为Ser/Thr蛋白激酶,Tyr蛋白激酶以及双特异性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MAPK,CDPK,JNK等。这种类型的蛋白激酶目前研究的较多,并且在信号传导途径中起重要作用。而酪氨酸蛋白激酶分为两类,一类是非受体型酪氨酸蛋白激酶,以src基因产物为代表,此外还有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Abl等;另一类是受体型酪氨酸蛋白激酶,根据它们的结构不同,受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型。在动物细胞中,酪氨酸蛋白激酶往往参与程序性细胞死亡、癌变等重要细胞行为。植物中酪氨酸蛋白激酶研究较晚。MayaMayrose等人的工作表明,西红柿中的双特异性激酶
LeMPK3能够提高植物对病原体的抵抗。文献提出,在受到病原体的侵害后,LeMPK3激酶的活性首先提高,然后LeMPK3的mRNA的表达量也短暂的提高。2002年,ParvathiRudrabhatla等人从花生cDNA文库中得到一个双特异性蛋白激酶,具有丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性。并且发现,该激酶的mRNA表达水平以及激酶活性受到低温和高盐胁迫的诱导。但是其蛋白表达水平却没有明显的变化。在250mM浓度的NaCl处理24h下,STY的mRNA表达水平提高了20倍,在4°C条件下处理24h,其mRNA表达水平提高了50倍左右。在IOOmMABA处理下,STY表达量没有变化。
[0008]目前,在许多植物中都发现蛋白激酶参与抗病,抗逆境等信号传递过程(ParvathiRudrabhatla,2002;LizhongXiong,2003)。ParvathiRudrabhatla等认为,花生中的一种STY激酶参与了花生对非生物胁迫的起始相应,证明了一种非MAPK途径的蛋白激酶级联信号传递过程在非生物胁迫中起重要作用。LizhongXiong等人认为,水稻蛋白激酶0sMAPK5能够提高水稻对低温,干旱,高盐以及病害等的抗性。而JenSheen认为,钙离子依赖的蛋白激酶⑶PK(⑶PKland⑶PKla)能够激活与植物抗逆境相关基因的启动子,参与植物逆境信号传导过程。RiichiroYoshida等报道,在拟南芥中ABA诱导的蛋白激酶SnRK2在植物响应脱水胁迫的信号传导过程中起到重要的作用。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状,依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此,利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达,从而增强植物的抗逆性,已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
[0009]综合目前的研究结果,蛋白激酶在植物响应逆境胁迫的信号传导途径中占有重要的地位。蛋白激酶通过自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性,通过磷酸化底物提高或者降低底物蛋白的酶活性,然后底物蛋白又调控下游基因的酶活,形成一个级联调控途径。如RAS信号调控途径,在细胞受体酪氨酸蛋白激酶感受到配体的信号后,形成二聚体并发生自身磷酸化,激活RAS,然后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的级联反应。这种级联调控是一种很精密很复杂的调控网络,蛋白激酶可能在上游作为一种开关在行使其功能。
【发明内容】
[0010]本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaPK及其编码基因。
[0011]本发明提供的一种蛋白,来源于小麦属小麦(TriticumaestivumL.),是如下(a)或(b):
[0012](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0013](b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列I衍生氨基酸序列组成的蛋白质。
[0014]上述蛋白中,一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015]上述序列表中序列I的氨基酸残基序列由601个氨基酸残基组成。
[0016]编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
[0017]上述基因为如下I)-3)中任一一种的DNA分子:
[0018]I)序列表中序列2所示的DNA分子;[0019]2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子;
[0020]3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
[0021]上述严格条件为在6XSSC,%SDS的溶液中,在65°C下杂交,然后用
2XSSC,%SDS和IXSSC,%SDS各洗膜一次。
[0022]上述序列2由1806个核苷酸组成,开放阅读框架为自5'端第I至1806位。
[0023]含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0024]上述重组表达载体为将上述基因插入pBI121中得到的重组载体,具体为将序列表的序列
2自5’端第1-1806位核苷酸所示的DN***段插入pBI121的SmaI和SpeI酶切识别位点之间得到的重组质粒。
[0025]扩增上述基因的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围,上述引物对由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子组成。
[0026]上述的蛋白或上述基因或上述的重组表达载体在调控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。
[0027]上述应用中,所述调控植物耐逆性具体为提高植物耐逆性;所述耐逆具体为耐盐、耐高温和/或耐低温。
[0028]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0029]本发明提供的方法,是将上述基因导入目的植物中,得到转基因植物;所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物。
[0030]上述基因通过上述重组表达载体导入所述目的植物中。
[0031]上述方法中,所述耐逆为耐盐、耐高温和/或耐低温。
[0032]上述方法中,所述高温为42度,所述低温为3度;
[0033]所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物,所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0034]本发明的实验证明,本发明发现的基因TaPK在低温、高盐和高温的诱导下表达,且将
TaPK基因导入拟南芥中得到的转基因拟南芥,其对以上三种逆境的抗性高于野生型拟南芥,本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础,将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为转基因拟南芥高温胁迫处理萌发实验及后期生长的结果
[0036]图2为转基因拟南芥低温胁迫处理萌发实验及后期生长的结果
[0037]图3为转基因拟南芥盐胁迫处理萌发实验及后期生长的结果
[0038]图4为转基因拟南芥高温胁迫处理存活率结果
【具体实施方式】
[0039]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0040]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。[0041]下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。
[0042]实施例1、TaPK的克隆
[0043]一、TaPK的克隆
[0044]将水培生长10天左右的普通小麦(TriticumaestivumL.)品种小白麦(,公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得,公众也可从国家种质资源库获得(编号为ZM242);提及小白麦的文献为:孙海桃等,小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选,中国农业科学,2011,44(22):4740-4747.;提及小白麦的文献为:-responsivefactorI(TaERFI)thatincreasesmultiplestresstolerance,PlantMolBiol(2007)65:719-732,ZhaoShiXu,LanQinXia,MingChen,XianGuoCheng,RuiYueZhang,LianChengLi,YunXingZhao,YanLu,ZhiYongNi,LiLiu,ZhiGangQiu,YouZhiMa)三叶期幼苗NaCl处理2小时,用液氮速冻,-80°C保存备用。
[0045]采用Trizol法(TianGen)提取小白麦叶片总RNA,第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成dscDNA,%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0046]通过5’RACE和3’RACE的方法获得序列表中的序列2。
[0047]该序列表中序列2所示的基因命名为TaPK基因,其开放阅读框架为自序列表的序列2的5'端第1-1806位核苷酸,将该基因编码的蛋白命名为TaPK蛋白,该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列
1,由601个氨基酸残基组成。
[0048]上述序列2也可以通过人工合成。
[0049]实施例2、TaPK对植物耐逆性的影响
[0050]一、重组表达载体的构建
[0051]1、TaPK基因的克隆
[0052]根据TaPK基因的序列设计引物对(TaPK_121F和TaPK_121R),引物末端分别引入SmaI和SpeI酶切识别位点,
[0053]TaPK-121F:5,-TTACCCGGGATGGACGAGGACGAGTACTCT-3’(序列3);
[0054]TaPK-12IR:5’-AGAACTAGTCGATCACAGCAGCTTCGG-3(序列4)。
[0055]提取小白麦叶片总RNA,反转录得到cDNA为模板,用上述引物进行扩增,%琼脂糖凝胶电泳,。将该PCR产物送去测序,该PCR产物具有序列表中序列2,即为TaPK基因。
[0056](TaKaRa公司,CodeN0.:DV807A)。
[0057]2、重组表达载体的构建
[0058]①用限制性内切酶SmaI和SpeI(Promega,R6121,R6591)酶切步骤I回收纯化的PCR产物,回收酶切产物;
[0059]②用限制性内切酶SmaI和SpeI酶切植物真核表达载体