植物耐逆性相关蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的应用的制作方法.docx

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专利名称:植物耐逆性相关蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及生物技术领域,特别涉及植物耐逆性相关蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的应用。
背景技术:
环境中生物因素和非生物因素严重制约着植物的生长发育,其中高盐、干旱、低温、臭氧、辐射及重金属等非生物胁迫已成为主要的影响因素,这些非生物胁迫造成粮食作物减产量高达50%。植物通过长期的进化,形成了一系列完善的逆境胁迫应答机制,包括细胞水平的耐受和植株整体水平的协同应答。在应答反应中,转录水平的调节是最重要的。植物对高盐、干旱及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子,其性状受许多因子影响。一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达,通过增强一些关键的调节因子的作用来促进这些抗逆基因资源发挥作用,使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。在提高作物对环境胁迫的分子育种中,与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比,从改良或增强一个关键的转录因子调控能力着手,提高作物的抗逆性将是一种更为有效的方法和途径。因此应用
转录因子提高植物的抗逆性研究已经成为当今的研究热点。由于具有基因组小、染色体数为2X8(2n=16)、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高、与豆科主要作物亲缘关系较近等特点,截型苜蓿被选作豆科模式植物。研究表明,非生物胁迫(比如盐胁迫)会影响植物的结瘤,从而影响固氮,因此截型苜蓿的有些转录因子可能同时参与非生物胁迫和结瘤,这一点与拟南芥存在很大差异。基于以上特点,截型苜蓿成为研究豆科植物的热点。
发明内容
本发明的目的是提供植物耐逆性相关蛋白MtMYB在培育耐逆植物中的应用。本发明提供了来源于截型苜蓿(Medicagotruncatula)的未知功能蛋白的用途。本发明保护植物耐逆性相关蛋白MtMYB或其编码基因在培育耐逆植物中的应用;所述植物耐逆性相关蛋白MtMYB是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。所述植物耐逆性相关蛋白MtMYB的编码基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5,端第8至805位核苷酸所示的DNA分子;2)序列表中序列2所示的DNA分子;3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子;
4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC,%SDS的溶液中,在65°C下杂交,然后用2XSSC、%SDS和1XSSC,%SDS各洗膜一次。本发明还保护一种培育耐逆植物的方法,是将所述植物耐逆性相关蛋白MtMYB的编码基因导入目的植物中,得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述植物耐逆性相关蛋白MtMYB的编码基因具体可通过pl302_MtMYB导入所述目的植物中所述pl302-MtMYB是将所述植物耐逆性相关蛋白MtMYB的编码基因插入pCAMBIAl302的多克隆位点得到的重组质粒。所述耐逆性具体可为耐盐和/或耐干旱。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物,所述双子叶植物可为如拟南芥,如Columbia生态型拟南芥。植物耐逆性相关蛋白MtMYB的编码基因参与截型苜蓿的盐胁迫和干旱胁迫应答反应。将植物耐逆性相关蛋白MtMYB的编码基因导入出发植物,可以得到耐逆性显著高于出发植物的转基因植物,本发明对于培育耐盐、耐干旱的转基因豆科作物具有重要价值。目前的研究尽管获得了许多耐逆相关基因,但是,这些基因大多来自拟南芥、烟草等模式生物。由于在种属差异,拟南芥的耐逆基因转化其他植物,可能因为没有相应的信号传递通路,而不能提高转基因植物的抗盐能力。所以,需要深入研究多种植物的耐逆机制,挖掘耐逆基因。本发明从豆科模式植物截型苜蓿中通过芯片筛选到一个盐诱导后表达量显
著上调的转录因子基因MtMYB,通过农杆菌转化法将MtMYB导入拟南芥,经过潮霉素初筛、分子检测、萌发期盐胁迫和后期干旱胁迫等手段,筛选到抗盐和抗干旱能力显著提高的转基因拟南芥株系。将该基因导入经济作物苜蓿等豆科作物对培育耐盐耐干旱的转基因豆科作物有重要价值。
图1为载体pCAMBIA1302_MtMYB构建流程图。图2为T2代转基因拟南芥的分子水平检测;(a)为PCR扩增产物电泳图,1为IkbDNAladder,由下到上分别为250bp、500bp、750bp、lOOObp、1500bp、2000bp,2为空白对照,3为阴性对照,4为阳性对照,5-17为PCR阳性植株;(b)为阳性植株的RT-PCR扩增产物电泳图。图3为T3代转基因拟南芥NaCl胁迫下的萌发率统计图。图4为T3代转基因拟南芥抗干旱检测结果;(a)表型图;(b)存活率统计图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验,均设置三次重复实验,结果取平均值。截型苜蓿2007年2月申小叶购自法国INRABRC-MTR(BiologicalResourceCentreforthemodelspeciesMedicagotruncatulaL.)。Columbia生态型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥;野生型
)购自salk公司。农杆菌EHA105中国农业大学保证向公众提供;参考文献抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响,王萍等水产科学,200928(7)。实施例1、MtMYB基因的发现通过两次芯片实验建立截型苜蓿完善的苜蓿种子萌发期和苗期盐胁迫基因表达谱,并对受盐胁迫显著诱导的基因进行聚类分析和GO注释分析,对感兴趣的探针进行GeneBins水平的pathway分类分析,基本构建了苜蓿耐盐调控网络框架。在此基础上建立截形苜蓿盐胁迫表达数据库。本发明从芯片中筛选到一个盐诱导后表达量显著上调的转录因子MtMYB,在200mMNaCl诱导5小时后表达量上调20倍。将序列1所示氨基酸残基组成的蛋白命名为MtMYB蛋白(由265个氨基酸残基组成),将MtMYB蛋白的编码基因命名为MtMYB基因,其编码区如序列表的序列2自5’端第8至805位核苷酸所示。实施例2、转基因植物的获得及耐逆性鉴定一、转基因拟南芥的获得1、MtMYB基因的克隆(1)设计特异性引物对(MtMYB_5’和MtMYB_3’),由Invitrogen公司合成。MtMYB_5'5'-AGATCTGATGAGAGGTATGGATATTAAGGTTC-3';MtMYB_3,5,-GGACTAGTTCACGCAAGTAAATTGTATTTTATTTCA-3,。(2)提取截型苜蓿的RNA,反转录为cDNA;(3)以步骤⑵的cDNA为模板,用步骤⑴的特异性引物对进行PCR扩增,回收PCR扩增产物。(4)将步骤(3)的PCR扩增产物进行测序。PCR
扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。序列2中,第1-7是BglII酶切位点和保护碱基,第8-805是MtMYB基因序列,第806-813是SpeI的酶切位点及保护碱基。(5)将PCR扩增产物插入pMD18T-simpIe载体(购自TaKaRa生物工程公司),得到载体PMD18T-simple-MtMYB。2、重组载体(pl302_MtMYB)的构建构建过程如图1所示。(1)用限制性内切酶BglII和SpeI双酶切载体pMD18T-simple-MtMYB,回收小片段。(2)用限制性内切酶BglII和SpeI双酶切pCAMBIA1302(),回收载体骨架。(3)将步骤(1)的小片段与步骤(2)的载体骨架连接,得到重组载体pl302-MtMYB(在骨架载体pCAMBIA1302的BglII和SpeI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA;pCAMBIA1302-MtMYB)。3、转基因拟南芥的获得(1)农杆菌感受态细胞的制备
挑取农杆菌EHA105单菌落接种于IOOmlYEB液体培养基中,220rpm、28°C振荡培养至OD600=;转入无菌离心管,5000rpm离心5min,去上清,,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min;4°C>5000rpm离心5min,去上清,加入4ml预冷的含10%甘油(体积百分含量),轻轻悬浮;得到农杆菌悬浮液(EHA105感受态细胞),分装于无菌印
pendorf管中,每管200μ1,于液氮中速冻lmin,冻存于-70°C。(2)pl302-MtMYB转化农杆菌EHA105取Iyg重组载体pl302-MtMYB加入200μ1ΕΗΑ105感受态细胞中,混勻,静止5min;液氮中速冻lmin,37°C水浴5min,加入ImlYEB液体培养基,28°C、150rpm振荡培养4h;5000rpm离心3min,弃上清,,重新悬浮细胞;涂布于含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB固体平板上,28°C培养约48h。PCR鉴定阳性克隆,鉴定所用引物如下5,引物5,-ATGAGAGGTATGGATATTAAGGTTC-3,;3,引物5,-TCACGCAAGTAAATTGTATTTTATT-3,。结果显示pl302_MtMYB已经成功转入EHA105中,得到了重组农杆菌。(3)转化拟南芥①将重组农杆菌接种于IOml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基中,28°C、200rpm振荡培养过夜;②转化前一天以150比例(体积比)接种于200ml含相同抗生素的YEB培养基中,-,5,000rpm、15min离心集菌,重悬于渗入缓冲液(由蔗糖、L-77和水组成;蔗糖的质量百分含量为5%蔗糖,L-%),,即为重组农杆菌菌液;③采用Foraldip法将农杆菌转化花蕾期的拟南芥在Columbia生态型拟南芥抽苔4-5cm时剪去顶端花序,使腋生花序生长,剪时伤口应位于最高的茎生叶上方,约4-5天后进行转化,转化前要使土壤充分湿透且将大的花蕾去掉,只保留未开放的小花蕾;转化时
将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有200ml重组农杆菌菌液的容器中浸泡2-3min,浸泡完毕后,取出花盆,侧放于托盘中,盖上黑色塑料布,24hr后揭开塑料布,直立放置花盆,进行正常的光照培养,收获T1代种子。(4)转基因拟南芥的筛选和分子鉴定①转基因拟南芥的筛选T1代种子播种于含80mg/L潮霉素的MS固体平板上,4°C春化3天,置22°C光照培养箱中培养7-10天,转化体表现为真叶呈深绿色,根深长至培养基中,将转化体移至不含抗生素的MS培养基中,6-8天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种,收获的种子即为T2代种子。②DNA水平检测将T2代种子培育成植株,以各阳性株系的基因组DNA为模板(质粒pl302_MtMYB为阳性对照,Columbia生态型拟南芥的基因组DNA为阴性对照,水为空白对照),用如下引物进行PCR扩增5,引物5,-ATGAGAGGTATGGATATTAAGGTTC—3,;3,引物5,-TCACGCAAGTAAATTGTATTTTATT-3,。
PCR体系(),dNTP(25mM),5,引物(5ρθ1/μ1)1·0μ1,3,引物(5ρθ1/μ1)1·0μ1,ExTaq酶(5U/μ1)1·0μ1,模板(1μg/μ1)1·0μ1,。PCR程序为第一轮94°C变性5min;第二轮94°C变性50sec,56°C复性50sec,72°C延伸lmin,30个循环;第三轮
72°C延伸IOmin0反应结束后,%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,能扩增出MtMYB基因特异条带(约798bp)的植株为PCR阳性植株。结果见图2(a)。得到13个PCR阳性株系,其中两个株系为L21株系和L34株系。③RNA水平检测为了检测PCR阳性植株中MtMYB基因是否得到转录,进行RT-PCR检测。Actin2为参比,检测Actin2基因的引物对如下:5,-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3,;5,-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3,。、L21株系植株和L34株系植株的总RNA;、无污染的RNA为模板,用M-MLV酶(购自Promage公司)反转录RNA为cDNA;反转录反应体系():RNA(),,;将上述混合物混勻后,短暂离心将之收集于管底,70°C温育5min,再立即置于冰上5min,再加入以下成分5XM-,,RRI(40U/μ1),RTaseM-MLV(200U/μ1)1·0μ1,H2O1·85μ1;将上述混合物混勻,短暂离心将之收集于管底,在42°C温育60min,70°C反应15min,取出置于冰上,离心后储存于_20°C。,PCR体系及程序与步骤②相同。反应结束后,%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,能扩增出MtMYB基因特异条带(约798bp)的植株为RT-PCR阳性植株。结果见图
2(b)。结果表明L21株系和L34株系确实为转MtMYB基因植株。将L21株系进行自交,得到T3代种子,将其培育为T3代植株。将L34株系进行自交,得到T3代种子,将其培育为T3代植株。4、转空载体对照拟南芥的获得用pCAMBIA1302代替重组载体pl302_MtMYB,其它同步骤3,得到转空载体对照拟南芥。二、转基因拟南芥的耐逆性鉴定分别将Columbia生态型拟南芥(WT)种子、L21株系拟南芥(T3代种子)、L34株系拟南芥(T3代种子)和转空载体对照拟南芥(T3代种子)进行盐胁迫实验和干旱胁迫实验,每个株系90粒种子。1、盐胁迫实验将拟南芥种子种于含有220mMNaCl的MS培养基上,4°C春化72hr,光照培养7天,进行萌发率计算(以根长Imm为萌发标准)。统计结果如图3所示。%,%,%,转空载体对照拟南芥种子的萌发率与Columbia生态型拟南芥相同。L21拟南芥和L34拟南芥种子的萌发率显著高于Columbia生态型拟南芥和转空载体对照拟南芥,表明MtMYB基因增加了拟南芥的抗盐能力。
2、干旱胁迫实验将拟南芥种子种于种于MS培养基上,4°C春化72hr,光照培养7天,转移到培养土(营养土蛭石=11),分成干旱处理组和对照组干旱处理组饶水3周后,干旱处理(不浇水)2周,复水4天后拍照,并计算存活率。对照组正常浇水,与干旱处理组同时拍照并统计存活率。照片见图