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植物耐低温蛋白tcf1及编码基因和应用的制作方法.docx

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专利名称:植物耐低温蛋白tcf1及编码基因和应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及1种植物耐低温蛋白TCFl及编码基因和相关转基因应用。
背景技术:
温度是植物生长发育所必需的环境因子,影响植物生长发育的所有过程,也是限制作物产量和分布的一个主要因素。冷害引起粮食作物大幅度减产是世界范围内普遍存在的问题。据估计,每年全世界仅用于减轻霜冻的危害就需要花费数亿美元(Pearce1999)。因此,阐明植物抗寒的机理,不仅有着重要的科学理论意义,而且具有重要的应用价值。在过去的20年中,由于模式植物的利用和相关功能基因的发现,使得我们在对植物抗逆如抗旱、盐碱分子机制的研究方面取得了很多突破性的进展。但是与植物抗旱和抗盐碱的分子机制的研究相比,对植物抗冷机理的研究相对滞后,用生物技术培育抗冷作物新品种的工作也比较落后。长期以来,人们主要用传统遗传育种的方法对农作物的抗逆性进行改良,然而这种方法具有效率低、周期性长的缺点,并且随着长期的使用其效果越来越不明显。利用转基因技术将抗逆相关基因转化到农作物中是提高其抗逆性的一个更直接有效的途径和必然趋势。因此,采用正反向遗传学和综合现代生物技术的研究方法,加快克隆植物感受冷信号及信号转导途径的重要基因,理解这些基因的功能和调控的网络的工作就变得非常紧迫。在植物受到冷胁迫后,染色质发生多种变化
(CheungPetal2000;ReaSetal2000;StefanowskaMetal2002;HeYetal2003;BastowRetal2004;KumarandWigge2009),如组蛋白的修饰,组蛋白与DNA的结合情况,从而调控相关基因表达,影响蛋白质与代谢物质的合成与降解,使植物体内重新恢复物质和能量代谢平衡,帮助植物应对冷胁迫,以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受低温胁迫诱导表达,这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答,而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径,从而使植物避免或减少伤害,增强对低温胁迫的抗性(XinandBrowse2000)。与低温胁迫相关的基因产物可以分为两大类第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物低温等胁迫应答的基因产物;第二类基因编码的产物包括参与低温胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子,如蛋白激酶、转录因子等(Liuetal2000)。目前,在冷驯化中起重要作用的基因已经在模式植物拟南芥中被克隆,并且转化到植物中提高了转化植株的冷耐受能力(Jaglo-Ottosenetal1998;Gilmouretal2000)
,其中研究的最为清楚的是以拟南芥的CBFS(CRT-bindingfactorl)转录因子为代表,包括CBFs的上下游发挥功能的各个基因所介导的冷信号通路;但是除了CBFs转录因子介导的冷信号通路外,其他独立于CBFs转录因子之外的冷信号通路的研究也取了一些进展(Zhuetal2004;Xinetal2007;Zhuetal2008);另外利用拟南芥同源克隆在农作物中克隆出大量基因,以及在作物中克隆的一些冷相关基因(WorrallDetall998;FanYetal2002;Guoetal2007)转化农作物均提高其冷耐受能力,这些进展不仅丰富了植物冷信号通路,而且为农作物育种提供思路,使得植物抗冷机制方面的研究深入到分子水平,并与遗传学和遗传工程研究相结合,达到用生物技术来探索和改进植物生长特性,提高植物对低温适应能力的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐低温蛋白TCFl及编码基因和相关转基因应用。本发明提供的蛋白质,来源于模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana),命名为TCFl,为一种人类RCCl(Regulatorofchromosomecondensation1)蛋白的同源蛋白。TCFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列1中TCFl
蛋白质由488个氨基酸残基组成,含有6个RCCl重复结构域,人类的RCC1(NP_00U60)蛋白含有7个RCCl重复结构域,TCFl蛋白与RCCl蛋白具有类似的功能结构域分布(图1)。将TCFl蛋白质序列在Genabnk上进行比对,发现TCFl蛋白与植物物种同源蛋白序列具有较高一致性,如与葡萄有67%的一致性,与蓖麻有68%的一致性,与水稻有61%的一致性,与高粱有63%的一致性,与杨树有57%的一致性,与小立碗藓有52%的一致性,而与人类RCCl蛋自仅有37%的一致性。为了使TCFl蛋白便于纯化与检测,可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
标签’残基序列GST231MSP1LGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSC-myc10EQKLISEEDL编码所述蛋白的基因TCFl也属于本发明的保护范围。所述TCFl基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5,端第67至1527位核苷酸所示的DNA分子;2)序列表中序列2所示的DNA分子;3)与1)或2)
限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。序列2中的cDNA序列由1723个核苷酸组成,开放阅读框架为自5'端第67-1527
位核苷酸。含有所述基因的重组表达载体、重组菌和转基因植株均属于本发明的保护范围,序列表中序列3为所述基因的启动子序列,亦为本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因及含启动子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物基因枪转化法所用的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DN***段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端,如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子,如烟草花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子⑴biquitin),它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外,使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻泽。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因
(⑶S基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选杆性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为pCAMBIA1300-35S-TCF1,pEZR(K)LC-35S-GFP-TCFl,pEZR(K)LC-Ptcfi-GFP-TCFI和pCAMBIA1391_PTCF1-⑶S,所用载体为pCAMBIA1300和pEZR(K)LC(Brownetal2005)。所述pCAMBIA1300_35S_TCFl为将所述基因插入pCAMBIA1300的多克隆位点得到的重组质粒,优选为将序列表中序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DN***段插入pCAMBIA1300的限制性内切酶KpnI和Mil酶切识别位点之间得到的重组质粒;所述pES(K)LC-35S-GFP-TCFl为将所述基因插入pES(K)LC的多克隆位点得到的重组质粒,优选为将序列表的序列2自5'端第67-1527位核苷酸所示的DN***段插入pES(K)LC的限制性内切酶EcoRI和MlI酶切识别位点之间得到的重组质粒;所述pEZR(K)LC-Ptcfi-GFP-TCFI是以pEZR(K)LC-35S-GFP-TCFl
载体为基础,将TCFl基因自身启动子片段(序列3)取代35S启动子获得的重组质粒,优选为将序列表中序列3所示的DN***段插入到pES(K)LC-35S-GFP-TCFl载体的限制性内切酶HindIII和McI切识别位点之间得到的重组质粒;pCAMBIA1391-PTeF1-GUS是将TCFl基因自身启动子片段(序列3)克隆到双元载体PCAMBIA1391上而获得的重组载体。本发明还保护一种培育耐寒性转基因植物的方法,是将所述TCFl基因导入目的植物中,得到耐寒性高于野生型的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体PCAMBIA1300-35S-TCF1导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物,如水稻等;也可以是双子叶植物,如拟南芥(如哥伦比亚生态型拟南芥)等。所述耐逆性具体为耐寒(抗寒)。扩增所述基因或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的TCFl基因受低温胁迫特异诱导表达;TCFl蛋白定位到细胞核上,是人类RCCl蛋白的同源蛋白,但TCFl与人类RCCl作用机制不同。TCFl能够与组蛋白结合且与组蛋白H4结合紧密。本发明的TCFl基因缺失和过表达TCFl基因可以提高植物的耐寒性,将在培育抗寒性的植物育种中发挥重要的作用。
图1为拟南芥TCFl蛋白与人类RCCl蛋白功能结构域分析结果。图中绿色圆球所示为RCClrepeats结构域。图2为Col-O中TCFl基因在受低温,ABA,NaCl,Mannital胁迫下的半定量PCR图谱。A图为Col-O在4°C处理0h,3h,6h,12h,24h,48h,Oday,lday,3day,5day,7day结果。B图为7天后取整株苗放在含有以下物质的培养基上进行胁迫处理ABA100μM5h,NaCl300mM3h,Mannital400mM3h,整个处理过程在培养室(22°C)内进行。图3为tcf1-1突变体在受低温,ABA,NaCl,Mannital胁迫下,TCFl基因的表达情况。生长7天的tcf1-1突变体分别受到以下非生物胁迫处理4°C处理0h,6h,12h和Mh;100μMABA5h;400mMMannital3h;300mMNaCl3h。图4为TCFl基因在tcf1+TCF1转基因植株中的表达情况。tcf1-1+TCF1代表在tcfl-Ι内过表达TCFl基因,Vector+tcfl-Ι代表在tcfl_l内转入空载体pEZR(K)-LC。图5为tcfl-Ι突变体受低温胁迫处理后表现出冷耐受能力。移土3周的幼苗直接放在冷冻箱进行冷处理,左边为表型处理结果,右边为1周后的存活率统计数据。图6为tcfl-Ι突变体受低温胁迫处理后表现出冷耐受能力。移土3周的幼苗首先放在4°C冰箱进行冷驯化7天,然后进行冷冻处理。左边为表型处理结果,右边为1周后的存活率统计数据。图7为TCFl基因过表达转基因植株
TCFlOX受低温胁迫处理后表现出冷耐受能力。A为移土3周的苗在-10°c处理浊表型结果。NA(-10°C,2h)表示未冷驯化,CA(_10°C,2h)表示4°C冷驯化7day;B为RT-PCR鉴定TCFl基因在各个转基因植株中的表达情况,C为处理后一周统计的存活率情况。图8为GFP-TCFl融合蛋白在拟南芥叶子表皮细胞中的核定位。A和C显示GFP空载体对照,B和D为TCFl定位于细胞核中,其中A,B为暗视野,C,D为明视野。图9为TCFl蛋白GEF活性检测。RCCl有20%GEF活性,TCFl有5%GEF活性。图10为TCFl蛋白能与组蛋白相互结合。泳道1是蛋白质未加入组蛋白磁珠的量,来表明上样量一致性,泳道2是经过组蛋白磁珠结合后剩下的上清液,泳道3是结合到组蛋白磁珠上的蛋白质。图11为TCFl蛋白与组蛋白H3,H4结合紧密。None表示PCR管中没加4种组蛋白的样品,All表示PCR管中加入4种组蛋白的样品,其余表示PCR管中加入各种单一组蛋白。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。实施例1、TCFl基因的表达特性及TCFl基因的克隆一、TCFl基因在逆境下的表达特性分析取室温生长12d左右的拟南芥Col-O幼苗进行以下胁迫处理
(1)低温处理将拟南芥Col-O幼苗置于4°C培养箱,光照培养O小时、1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻,_80°C保存备用。(2)脱落酸处理将拟南芥Col-O幼苗置于100μM的脱落酸(ABA)溶液中,光照培养3小时后取出并用液氮速冻,-80°C保存备用。(3)盐渍处理将拟南芥Col-O幼苗置于150mM的NaCl溶液中,光照培养5小时后取出材料,用液氮速冻,-80°C保存备用。(4)Manital处理将拟南芥Col-O幼苗置于300mM的Mannitol溶液中,光照培养5小时后取出材料,用液氮速冻,-80°C保存备用。二、组织表达特异性(I)RT-PCR方法取常温和4°C处理12h的Col-O组织R,根;Sh,茎;L,叶;F,花;
Si,果荚,用液氮速冻,_80°C保存备用。(2)⑶S染色方法将TCFl基因启动子(序列3)克隆到双元载体pCAMBIA1391,获得重组载体pCAMBIA1391-PTCF1-GUS。将重组载体采用蘸花法转化到野生型Col-O中。后代分离出的纯和转基因植株在4°C冷处理1和未经冷处理情况下进行GUS染色,观察其TCFl基因组织表达特异性。三、mRNA的提取及RNA反转录采用Trizol法(TianGen)提取拟南芥总RNA;将提取的mRNA用ftx)mege公司反转录试剂盒反转录为cDNA。四、RT-PCR结果分析将Col-O的cDNA用作半定量RT-PCR的模板。用TCFl基因全长引物对对样品进行扩增,分析基因对各种胁迫处理的应答情况及各组织中表达情况,以

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