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专利名称:植物生防菌定向筛选理论与应用的制作方法
技术领域:
本发明属于农业领域中生防菌的筛选方法,该方法为定向筛选方法,筛选的生防菌与靶标植物具有紧密关系,保障了筛选生防菌的田间有效性,克服了以往生防菌筛选的盲目性,屏除了许多无效的生防菌。
背景技术:
现在文献报道筛选的生防菌种类繁多,包括生防真菌、生防细菌、生防放线菌等,但能真正推向市场的生防菌剂非常少。究其原因,主要是目前市场上和实验室正在开发的微生物制剂有如下一些缺陷1)生防菌在田间自然条件下定殖能力差。大多数生防菌是在实验室条件下筛选鉴定的,培养基设计与田间自然条件有很大区别,由此筛选的生防菌往往田间定殖能力不强,其种群数量很快下降并恢复到其本身的生态地位,形不成足够的生态抗病效应而达不到应有的防效,这成为生防菌商品化的一个最大制约因子2)在不同土壤、气候条件下田间防治效果不够稳定,主要是因为该菌对PH值、土壤营养、通气条件等要求苛刻,所以在不同地区、不同田块的效果不同;3)现在的生物防治均为单一菌剂,没有联合不同生防菌的立体优势,降低了生防菌剂的防治效果。针对以上生防菌缺陷,如何筛选能在田间发挥高效抗病作用的生防菌是目前生防
菌面临的一大难关。
发明内容
本发明提出了“植物生防菌定向筛选理论”,其核心思想就是利用特殊培养基定向筛选与靶标植物密切相关的生防菌,确保了筛选的生防菌为根际或植物体内优势抗病菌群;同时通过筛选时生防菌出现频率来配比其在复合生防菌剂中所占比例,克服单一菌株的不足。应用该理论可快速、高效解决植物维管束病害、土传病害等一类植物生产中的癌症,目前这类病害化学农药基本无效果,抗病品种也没有取得突破。应用实例以生姜姜瘟病为例,山东莱芜地区发生了严重的新型姜瘟病,用***化苦等灌根均无效果,我们首先对发病样本进行了分离,发现是一变异的劳尔氏青枯菌,毒力远高于普通型劳尔氏青枯菌。对于这类病害只有从生物防治角度去处理,才能收到良好效果。1)筛选培养基配制大烧杯装含水量7%的沙土,灭菌处理。取健康生姜500g,洗净,用75%酒精表面消毒,晾干,埋入上述沙土中,置于25°C温箱让其发芽生根,生长10天后,用自来水洗净沙土,去芽,称取带根生姜100g,用IOOml无菌水在研钵中磨碎,过滤取滤液,做为培养基主成份;,最后加水直至1000ml,灭菌后倒平板,即为筛选生防菌平板。液体筛选培养基不需添加琼脂。2、筛选流程取健康湿润生姜田土样,混勻,取5g土样于上述IOOml液体筛选培养基中,于
28°C下进行富集培养3天。
取上述培养液100μ1均勻涂布于筛选平板上,于28°C下恒温培养36小时,挑出疑似芽孢杆菌菌落。制作含姜瘟病菌的固体培养基(1%蛋白胨+%酵母粉+1%葡萄糖+%琼月旨,灭菌后冷却到50°C时,%比例加入其中,制作平板),将大量筛选疑似芽孢杆菌用牙签挑入此平板中,寻找周围有透明圈的菌落进行纯化。然后进行二次筛选,将初筛有抗菌活性的菌落集中到一个筛选平板上,观察抑菌圈的大小,挑选活性最高的5-10个菌落。通过致病性测定进一步淘汰把生姜表面消毒后,切成厚度Icm的块状,把筛选的生防菌逐个接种到生姜切面,24小时后观察该菌是否对生姜具有致病作用,筛除具有致病作用的菌株。然后对剩下的生防菌在盆栽情况下做实验,观测每个菌的抗病效果,对效果较好的逐个测定其16srDNA序列,结合生化及形态学鉴定生防菌的种属地位。对上述鉴定不一样种属的菌株进行配合,观测其联合效应,对具有稳定良好防效的配合菌剂经过盆栽实验后,推广到大田,最后申报生物农药登记试验,逐步推向市场。本课题组采用这种分离方法,从中筛选具有高抗生姜姜瘟病菌的生防细菌,现已筛到3株具有高抗病活性、能在棉花根际快速繁殖的根际优势菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YUPP-8,赌状芽孢杆菌(Bacilluscereus)YUPP-9,类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)YUPP_10
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权利要求
本发明提出了一种“植物生防菌定向筛选理论”,其核心内容就是选用与适用植物相关的特殊培养基,筛选与靶标植物具有定向关系的、能在植物体内或根际占据优势生态位的抗病菌群,并能根据各生防菌出现频率来配比符合生防菌剂,从立体空间全方位阻止有害病菌的入侵。。
“植物生防菌定向筛选理论”所需特殊培养基制备,其特征在于特殊培养基主要成分为适用植物的根系分泌物与植物地下部分的提取物制取的培养基。
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、提高植物抗性及提高植物产量上的用途。
全文摘要
本发明涉及到一种分离生防菌株的新理论方法及其应用。以往筛选植物生防菌的方法通过大海捞针式筛选,得到可能具有生防潜能的菌株,其田间效果在很大程度上具有不确定性。本发明提出了一种新的方法“植物生防菌定向筛选理论”,其核心内容就是选用与靶标植物密切相关的特殊培养基,筛选与靶标植物具有定向关系的、能在植物体内或根际占据优势生态位的抗病菌群,并能根据各生防菌出现频率来配比符合生防菌剂,从立体空间全方位阻止有害病菌的入侵。该理论方法克服了以往生防菌剂筛选的缺陷,屏除了很多无实际应用价值的生防菌株,能在较
短的时间内筛到具有实际田间防效的生防菌株。应用本发明筛选到针对棉花枯黄萎病、魔芋软腐病、西瓜枯萎病、番茄青枯病、生姜姜瘟病等的生防菌群,由此开发的生防菌剂应用于盆栽及大田试验,结果表明定向筛选的生防菌剂防效优良,平均防效可达80%以上,该理论方法具有巨大的应用前景。