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荧光定量PCR(Real-timePCR),是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团,
通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未
知模板进行定量分析的方法。
以探针法荧光定量PCR为例:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
传统的PCR进行检测时,扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离,并且只能作定性分析,不能准确定量,易造成污染出现假阳性,使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量,且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好自动化程度高和无污染的特点,使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。
在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这
样的直线即是基线,这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指
数增长期,这个期间扩增曲线具有高度重复性,在该期间,可设定一条荧光阈值线,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般会将荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值,这个值与起始浓度的对数成线性关系,且该值具有重现性。
o
til
15
3t
Cycles
cr
平台期
星线期
指数增反期
基线
阈值线
Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量,此时就有两个概念容易被提及,那就是绝对定量和相对定量,绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果,但是绝对定量实验必须使用已
知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线,也可以不做
标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取,实验室基本都是选择相对定量的方法来
行梳理。
常规荧光定量PCR的流程是:样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录(RNA病毒)-扩增-结果读取。
下面看看各个环节都可以使用哪些对照?
1、阳性对照和阴性对照阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下,比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染样品,都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。阴阳性对照强调处理过程与样品一致,并且有明确的预期结果。
2、扩增对照我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照,更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板,扩增阴性对照应含有阴性扩增模板(基质核酸)。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常,不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测RNA样品的检测试剂盒,其扩增阳性对照使用质粒便无法监控反转录过程。
3、内标(InternalControl,IC)
内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式,一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标,另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增,而其他的对照都是独立扩增。
(1)内参基因
通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因(house-keepinggene)因为其表达水平受环境因素影响较小,而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括GAPDH、B-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
内参基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序,可以监控采样运输,核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种,不同生理状态下,不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液,咽拭子等样品,内参基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。
(2)人工内标
添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标。现在国外的诊断试剂盒大部分都会将内标直接添加在反应液中与模板一起扩增,但是这样的内标不能监控采样运输和核酸提取的过程。
还有另一种形式的内标,使用人工合成的假病毒,在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标,这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。但是由于是人工添加到样品中,仍然不能监控胞内细菌病毒的释放情况。
4、核酸提取对照可以使用内参基因,假病毒混合基质,灭活病毒混合基质来监控提取到扩增的流程。
5、反转录对照(RTcontrol)
可以使用提取好的RNA内参基因,RNA假病毒混合基质,灭活RNA病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。
无反转录对照(no-RTcontrol)含有除反转录酶以外的所有成分。
6、空白对照(Blankcontrol)
(1)无模板空白对照
NTC是指不含有模板(阳性模板或者阴性模板)的对照。目前的试剂盒的NC一般都是水或阴性缓冲液,所以NC等同于NTC。其实两者有不同的作用。
(2)仪器空白对照
NTC是含有引物探针和反应液主要监控引物探针,反应体系有没有被污染。这
里的仪器空白对照我通常使用的是空反应管来监控仪器有无非特异性的荧光信号。
(3)荧光染料对照
最常使用的是ROX染料,由于荧光定量PCR的荧光信号在每个样品孔会有微小的差异所以使用特定的ROX荧光染料,系统可以根据ROX荧光染料的信号值来校准每孔的荧光信号。
7、质控品(Qualitycontrol,QC)上述环节中使用的各种对照大部分是试剂厂家匹配试剂盒使用的产品,有的是实验室自制,所以整个的监控过程可能存在不够客观和独立。因此在实验室的对照设置中每次检测都建议使用第三方质控品,有条件的使用国家有证标准物质(Referencematerial,RM)。由于标准物质具有准确量值和计量溯源性,可以更准确的评估整个试验流程的准确度。
8、定值参考品
医学上的定量检测试剂盒,需要配套定值参考品用于试剂盒的定量检测使用。
对照的选择
从上文可知没有一种对照是完美的,在检测中我们要根据自己的需求来进行灵活选择和搭配。笔者建议每一次检测时添加一个能对从提取到扩增环节进行监控的质控品或标准物质;每份检测样品中添加内标(如果样品种类比较多样建议使用人工内标,如果样品类型为相对固定的动物组织建议使用内参基因);扩增阳性对照,扩增阴性对照,无模板对照和ROX对照。有条件的添加临床阳性对照和临床阴性对照,在怀疑提取环节或者反转录环节出现问题时使用核酸提取对照和反转录对照不定期使用仪器空白对照。
阳性对照与污染
不可否认的一个事实是阳性对照可以增加实验室污染的风险。这种污染的来源一种是直接来源于扩增阳性对照的污染。对于扩增阳性对照来说通常10000拷贝/微升(CT值约25)是比较理想的,但是有一些试剂盒厂家的扩增阳性对照设置在CT值20以下,比大部分阳性样本都强。这么高浓度的对照给实验室带来了巨大的污染风险,原因可能仅仅是因为试剂厂家担心其阳性对照不稳定,长时间存放阳性对照降解。另一种污染来自于扩增产物的处理不当,或者实验室的设计布局不合理。
初筛和确诊
对照与实验目的的关系好像从来没有人提及过。根据笔者多年在检测实验室的经验,分享一点个人的心得,欢迎大家批评指正。
对于初筛实验,我们希望提高真阳性检出率,即提高诊断敏感性。我们需要检测系统达到最高检测效率,因此要在不同环节添加阳性对照,确保每个环节的检测效率最高。
对于确诊实验,我们希望提高真阴性检出率,即提高诊断特异性。我们需要确保检测系统不出现假阳性,因此要在不同环节添加阴性对照,减少非必须的阳性对照,甚至要在样品盘的不同位置中随机插入几个阴性对照,确保实验过程中没有被
污染。
分子生物学研究
1、核酸定量分析:对传染性疾病进行定量定性分析,病原微生物或病毒含量
的检测,比如近期流行的甲型H1N1流感,转基因动植物基因拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测等。
2、基因表达差异分析:比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证
3、SNP检测:检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义,因分子信标结构的巧妙性,一旦SNP的序列信息是已知的,采用这种技术进行高通量的SNP检测将会变得简单而准确
4、***化检测:***化同人类的许多疾病有关,特别是癌症,Laird报道了一种称作Methylight的技术,在扩增之前先处理DNA,使得未***化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而***化的胞嘧啶不受影响,用特异性的引物和Taqman探针来区分***化和非***化的DNA,这种方法不仅方便而且灵敏度更高。
医学研究
1、产前诊断:人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗,到目前为止,还只能只能通过产前监测,减少病婴出生,以防止各类遗传性疾病的发生,如为减少X连锁遗传病患儿的出生,从孕妇的外周血中分离胎儿DNA,用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法,易为孕妇所接受。
2、病原体检测:采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
3、药物疗效考核:对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)定量分析显示:病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达,干扰素治疗作用不敏感,而HCV低滴度,干扰素作用敏感;在拉米夫定治疗过程中,HBV-DNA的血清含量曾有下降,随后若再度上升或超出以前水平,则提示病毒发生变异。
4、肿瘤基因检测:尽管肿瘤发病的机理尚未清楚,但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变,而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病
WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
其它:如分析失败,将对同一原始样本进行检验。如仍不能发出报告者,分析原因并告知受检者重新采样检验。
相关文件
相关记录
末梢血采集作业指导书
。
。
物品准备:一次性采血针、75%酒精、无菌棉球、(EDTAK2抗凝管)、试管架、编号笔、微型震荡器、口罩。
检验申请单填写要求:
检验申请单用钢笔填写,使用正楷字,字迹清楚,填写完整。
填写内容包括:受检者姓名、性别、年龄、化验单编号、临床诊断、送检标本、检验项目、标本采集标本年月日时、申请医生及采样者签名。
:
查对检验申请单、受检者姓名及是否已按医嘱准备,向受检者解释操作目的,以取得合作。
常用选择无名指,先用酒精棉球消毒,然后用一次性采血针穿刺,让血液自然流出,用消毒棉球轻拭去第一滴后,(EDTAK2抗凝管),-。
用干棉球压住穿刺部位,嘱采血对象按压2-3分钟。
在微型震荡器混匀。马上送检。
采血前应核对好姓名和检验项目,明确标本要求。
血常规用EDTAK2抗凝管收集血标本后,在微型震荡器混匀,使血液与抗凝剂充分混匀。
除特殊情况外,不要在耳垂采血。婴幼儿可自拇指或足跟两侧采血。烧伤患者可根据情况选用皮肤完整的肢体末端。采血部位应无炎症或水肿。末梢采血不可用力挤压。
标本运输及实验前存放:
立即送检,如需保存,可置2-8C存放不超过8小时。
其它:如分析失败,将对同一原始样本进行检验。如仍不能发出报告者分析原因并告知受检者重新采样检验。
采样管理程序
标本管理程序
动脉血液采集作业指导书
,主要用做血气分析。
。
物品准备:止血带、一次性垫巾、无菌棉签、复合碘消毒液、注射器(数量和种类根据要求选取后检查灭菌日期、有效期及有无漏气)、试管架、编号笔、口罩。
检验申请单填写要求:
检验申请单用钢笔填写,使用正楷字,字迹清楚,填写完整。
填写内容包括:受检者姓名、性别、年龄、临床诊断、送检标本、检验项目、用药情况、抽血时的体温、是否用氧及其流量、标本采集年月日时、申请医生及采样者签名。
:
查对检验申请单、受检者姓名及是否已按医嘱准备,向受检者解释操作目的,以取得合作。
-5mL干燥注射器,按无菌手续抽取肝素抗凝素(1mL=1000U,生理盐水配制),来回抽动针栓,使针管全部湿润,将多余的肝素排出。
选择血管,常用股动脉、肱动脉或桡动脉。
用复合碘棉签消毒穿刺部位。
选择动脉搏动最强处穿刺。
穿刺
旋紧持针器上的针头,摘掉穿刺针上的保护套,试穿刺针是否通畅。
,穿刺成功后,采集动脉血2mL,用棉签压住进针处,拔出针头,嘱采血对象按压2-3分钟。
抽出后立即用一橡皮头封闭针头,隔绝空气,将注射器重于手中反复旋转搓动即达抗凝,立即送检。
采血前应核对好姓名和检验项目,明确标本要求。
采血中注意隔绝空气,空气中的氧分压高于动脉血,二氧化碳分压低于动脉血,从而使血液中PO2及PCO2都改变而无测定价值。
立即送检,血液不得放置过久,否则血细胞继续新陈代谢,影响数据准确。
,可将手及前臂浸人45C温水中20分钟,使局部静脉血动脉化,穿刺时勿用压脉带,只能缓缓吸引。
也可将手指或耳垂(婴儿取足跟、大趾或头皮)毛细血管热敷或按摩,充分动脉化,以容量100mL-140mL肝素化毛细玻管采血。针刺深度以血液自然流出为宜,收集时切忌气泡引入毛细玻管。
标本运输及实验前存放
立即送检。
如不能及时送检,应放入冰水中保存(勿用冰快,以防细胞破坏溶血)。
其它:如分析失败,将对同一原始样本进行检验。如仍不能发出报告者,分析原因并告知受检者重新采样检验。
相关文件
采样管理程序
标本管理程序
尿液标本采集作业指导书
、生化检验。
、生化项目所需尿液标本的采集。
物品准备:专用一次性尿杯、编号笔。
检验申请单填写要求:
检验申请单用钢笔填写,使用正楷字,字迹清楚,填写完整。
填写内容包括:受检者姓名、性别、年龄、化验单编号、临床诊断、送检标本、检验项目、标本采集标本年月日时、申请医生及采样者签名。
:
查对检验申请单、姓名,向受检者解释操作目的,以取得合作。
发一次性尿杯一个给受检者,嘱受检者留取新鲜尿立即送检,以清晨第一次中间段尿为宜。
受检者按要求自己用一次性尿杯留取半杯尿标本交检验科编号待检。
,可分为晨尿、随机尿、空腹尿、餐后尿、计时尿(2h、3h、12h、24h)等。一般定性分析测定,可在任意时间留取标本。常规定性分析,多采用晨尿。计时尿多用于肾功能和有形成分排出率的估计。许多定量分析需收集24小时尿液。微生物检验的标本应取尿道排出的中段尿并立即送检。一般尿液检查应留取新鲜尿液置清净、干燥容器中立即送检。(静脉滴注大剂量青霉素、VitC时可影响尿蛋白、尿糖及尿隐血结果,应尽量避免)。
特殊检验如尿妊娠试验、尿糖定性试验一般应取空腹晨尿送检。
标本应避免污染。一般定性分析标本,应在留取后马上检测。若需保存、或收集24小时尿液,原则上应首选0〜4C冷藏,必要时可添加化学防腐剂。常用的化学防腐剂有:
甲苯(或二甲苯):较常用,如24h尿糖定量、尿蛋白定量测定。100mL尿液中加1mL。不能制止尿液中已有细菌的繁殖。
***仿:防腐效果较甲苯好。可能干扰尿沉渣镜检。
盐酸:分析测定甾体激素及其衍生物或儿茶酚***以及含氮物质时常选用。100mL尿液中加1mL,或24小时尿液中10-15mL。
甲醛:。用于24h尿无机离子定量及艾迪氏计数测定可干扰尿糖测定和干化学法的白细胞测定。
其它:如分析失败,将对同一原始样本进行检验。如仍不能发出报告者,分析原因并告知受检者重新采样检验。
相关文件
采样管理程序
标本管理程序
粪便标本采集作业指导书
目的采集粪便标本以做粪便常规和其他检验。
适用范围适用于本科做粪便常规和其他检验项目所需粪便标本的采集。
物品准备:专用一次性尿杯、编号笔。
检验申请单填写要求:
检验申请单用钢笔填写,使用正楷字,字迹清楚,填写完整。
填写内容包括:受检者姓名、性别、年龄、化验单编号、临床诊断、送检标本、检验项目、标本采集标本年月日时、申请医生及采样者签名。
:
查对检验申请单、姓名,向受检者解释操作目的,以取得合作。
发一次性尿杯一个给受检者,嘱受检者留取粪便标本一小时内送检。