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专利名称:检测鸭瘟病毒抗体的ul55重组原核表达蛋白及制备方法
技术领域:
本发明涉及动物医学领域,涉及一种基因工程制品和其制备方法。具体地说是一种应用基因工程技术制备检测鸭瘟抗体的DPV-UL55基因重组原核表达检测抗原蛋白及其制备方法。
背景技术:
鸭瘟(duckplague,DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病。鸭瘟自上世纪20年代首先在荷兰被发现以来,已有80多年的历史了。该病在世界各养鸭地区都有分布,给世界各国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失。其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂,而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前,用于检测DPV抗体的方法大多是基于DPV全病毒作为抗原的检测方法。但其存在以下不足一是在操作过程中不可避免造成散毒;二是由于DPV全病毒作为诊断抗原其制备的复杂性以及纯度不够理想使其不易推广。阻碍了以全病毒作为诊断抗原监测DPV抗体的大规模应用。利用原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可以保持必要的抗原性,而且其制备和纯化过程相对简单,能够用于病毒感染抗体的检测。因此研究和应用
DPVUL55基因原核表达产物对于DPV预防和控制具有重要的理论和临床意义。
发明内容
本发明提供一种DPVUL55基因原核表达蛋白及其制备方法。其目的在于提供一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低,制备方法简单易于推广的检测鸭瘟病毒抗体的原核表达检测抗原及其制备方法。本发明的目的是这样实现的一种检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白,该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQIDNO:2的氨基酸序列表定义;是SEQIDNO:1核苷酸序列的原核表达产物。—种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法,包括以下步骤(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物;(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段;(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定;(4)将UL55基因定向亚克隆至pET3h原核表达载体;(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达;将重组表达质粒pET3h-UL55转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;(6)UL55基因表达蛋白的纯化;(7)重组UL55蛋白的复性和检测。所述的制备方法,步骤(6)具体做法为
①待纯化样的制备离心收集表达菌液收集诱导表达的菌液离心取沉淀,将菌体沉淀用20mmolTris-HCl()悬浮,直接进行包涵体洗涤法纯化重组
ULL55蛋白的或_20°C保存②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化取出离心收集并用20mmolTriS-HCl()悬浮的表达菌(-20V保存的菌体沉淀,室温下融化),超声波(冰浴)间歇破碎菌体O00w,30sec/次,510次),4"C10000r/min离心lOmin。将沉淀用20ml洗液(10mmol/LPBS+2mol/L尿素+1%TritonX-100+20mMTris-HCl+2mMEDTA)悬浮,4"C10000r/min离心IOmin后,沉淀再次用20ml洗液悬浮,重复洗涤五次后,用适量尿素溶液(lOmmol/LPBS+8M尿素+50mM"Tris-HCl+SOmMNaCl+lO^甘油)溶解沉淀,4°C保存备用。所述的制备方法,步骤(7)具体做法为将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mMTris-++lmMEDTA+ImMGSSG+IOmMGSSH)中,使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低,使变性蛋白逐渐复性,。4°C复性M48h,收集稀释复性的蛋白液,装入透析袋4°C透析(透析缓冲液50mMTris-+50mMNaCl++10%甘油+1%甘氨酸)M48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清,取其中20μ1进行SDS-PAGE分析,并以纯化的的兔抗DPV为一抗,以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Wfesternblotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度,分装后冷冻干燥浓缩备用。本发明制备的DPVUL55
重组原核表达检测抗原,是利用基因工程技术制备的基因工程制品。该产品的表达形式是一种融合蛋白。表达的融合蛋白的分子量为40KDa。将该产品的获得设计为融合表达主要鉴于便于融合表达蛋白的纯化和免疫原性的提高。该融合蛋白在表达时,大部分以非可溶性的包涵体形式表达,在纯化之前对包涵体采用了较为温和的包涵体裂解方式,因此包涵体蛋白裂解后又经复性处理后,经Westernblot鉴定后表明其具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。经裂解的包涵体蛋白经12个月仍保持良好的均质胶体状态,无析出和沉淀现象,表明状态稳定。采用本发明方法生产的产品可用于(1)可作为检测鸭瘟病毒抗体的Dot-ELISA和间接ELISA等方法的检测抗原。(2)可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。本产品的优点体现在(1)由于所制备的检测抗原是DPVUL55基因的原核表达重组蛋白,并非全病毒,因此应用此产品作为检测抗原无散毒危险。(2)所制备的产品作为ELISA抗原检测DPV抗体具有检测灵敏度高,特异性强,无交叉反应的特点。(3)制备工艺简单、产品性能稳定,成本低,产品附加值高,适合工厂化生产,易于推广,市场应用前景广阔。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,凡是涉及蛋白表达的均同时提供原始彩照和黑白照。图中涉及标记及含义如下图
I-A为DPVUL55基因的PCR扩增M指MakerIII相对分子质量标准;1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物;2指以DPVCHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小,约为799bp);图I-B为重组质粒pMD18-UL55的双酶切鉴定M1指相对分子质量标准III,M2为DL2000相对分子质量标准;1指重组质粒pMD18-UL55用BamHI和BioI双酶切得到的两个片段2指UL55PCR扩增产物(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp);图I-C为重组表达载体pET3h_UL55的单酶切和双酶切鉴定M1为DL2000相对分子质量标准;M2指相对分子质量标准DL15000;1是UL55基因的PCR产物;2指重组表达载体PET3M-UL55用BamHI和)(h0I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp);3指重组表达载体pET3h-UL55用BamHI单酶切后得到的线性质粒。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准;1为以BL21为表达宿主的pET3h空载加IPTG诱导;2、3分别为未加诱导剂的UL55表达产物的上清和包涵体;4、5分别为IPTG诱导所产生的上清和包涵体(箭头所示的蛋白质分子量大小约为40KD);图2-、、、0·6、0·4、0·2、;图2-C为不同温度诱导pET3h_UL55表达结果1_3的温度分别为37、30和25°C;图2-D为不同时间诱导
pET3^i-UL55表达结果1_5的诱导时间分别为4、5、6、7和8h。图3为重组UL55蛋白纯化效果和免疫原性的检测A,SDS-PAGE分析M为蛋白标准(KD);1为包涵体洗涤法纯化后透析复性的重组UL55蛋白;2为5次洗涤后的重组UL55包涵体蛋白;B,Westernblotting分析箭头所指是以兔抗DPV抗体为一抗检测复性的重组UL55蛋白(约为20KD)。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达检测抗原及制备方法1、材料方法以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。、质粒和毒株质粒pMD18-T,购自大连宝生物工程有限公司;原核表达质粒pET3h(+),Novagen公司产品;、(DE3)和DPVCHv强毒株,由四川农业大学禽病研究中心提供。
10日龄鸭胚,其种鸭DPV和抗体均为阴性;兔抗DPV抗体,由四川农业大学禽病研究中心提供。、2X傻瓜PCRMixture、DNA连接酶Mixture、限制性内切酶
BamHI和Xhol、UltraPure质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPureTMDNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad公司;其它试剂均为分析纯,购自上海生工生物技术有限公司。,参考UL55基因序列(GenBank登录号EU071034),由宝生物生物技术有限公司合成。引物序列F:5,-GGATCCATGGCCGACGCGAAGGCGGT-3’(划线部分为BamHI位点);R:5,-CTCGAGGCTTGGGTCTTTACTTTTTGCGCGGAAC-3(划线部分为XhoI位点)。合成后,以适量灭菌去离子水溶解,使其终浓度为20mmol/L,_20°C保存备用。,分别用5%碘酒和75%酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净,剪去头、翅、腿和内脏,PBS冲洗后将胚体剪成Imm大小的小块,加PBS适量,之后置于三角瓶内,加细胞分散剂(%的胰蛋白酶)15(^1/胚,于371水浴中消化;31^11。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min,倾弃上清,细胞沉淀用适量的MEM悬浮后,用5层纱布过滤,向滤液中加入10%小牛血清和100IU/mL双抗后,分装于IOOmL细胞培养瓶中,7mL/瓶,水平静置于37°C细胞培养箱中进行培养。
DEF,弃生长营养液,用灭菌PBS清洗细胞表面2次后,加入DPV病毒液23mL覆盖细胞表面进行吸附,37°C吸附120min后弃病毒液,然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液,之后37°C培养。同时做未接毒的DEF对照。(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60%70%的DEF(100mL细胞瓶);同时选取细胞形态正常的DEF作对照;(2)倾去细胞培养液,加入500μ1的细胞裂解液,同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL,轻轻混勻后,37°C孵育IOmin;(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中,并用500μ1的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物,倒入离心管中;(4)用饱和酚/***仿及***仿抽提2次,再用水饱和***处理2次;(5)加1/10倍体积3mol/LNaAC,混勻后,加入2倍体积冷无水乙醇,_20°C放置3060min;(6)13000r/min离心20min,沉淀用预冷的70%乙醇洗涤两次;(7)真空抽干后,溶于适量TE缓冲液中,加入1μ1RNA酶,37°C作用30min,_20°C保存备用。
(20pmol/μ)(20ρηιο1/μ1)
轻轻混勻,2000r/min瞬时离心后进行PCR。反应参数95°C预变性IOmin;94°C变性40s,°C退火40s,72°C延伸lmin,循环30次;最后72°C延伸lOmin,于4°C保存备用。取4μ1PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳,设MakerIII和空白对照,观察扩增片段的长度。、鉴定与测序在优化好的PCR条件下用保真PCRMixture扩增UL55基因,产物按大连宝生物公司的T克隆试剂盒说明书进行T克隆并送大连宝生物公司测序确认。将T克隆菌种接种于5ml的LB液体培养基(含Amp50μg/ml)中,37°C水浴振摇培养过夜,次日提取重组质粒,提取方法按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行,抽提的重组质粒命名为PMD18-UL55。然后分别以BamHI/XhoI双酶切消化与BamHI单酶切消化,%凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。酶切体系如下
BamHIBamHI/XhoIpMD18-UL55质粒8·\-
-UL55的构建、-UL55的构建与鉴定
)(h0I分别双酶切
PMD18-UL55质粒和原核表达载体pET3h(+),酶切体系均为
pMD18-UL55质粒原核表达载体pET32a(+)、超纯水补足至20μ137°C水浴4h,按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后,按照下列连接体系16°C连接过夜。
***化钙法制备Dffia感受态细胞。之后,取连接液10μ1加到含200μ1感受态Dffia的离心管中,混勻后冰浴30min;置于42°C水浴90sec,然后迅速冰浴anin;加入不含Amp的LB液体培养基800μ1,37°C振摇(150r/min);取200μ1培养物涂布于含IOOyg/mLAmp的LB平板,37°C培养过夜,次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中,37°C培养1216h,同时设立空载体转化组(空载体10μ1+感受态Dffia200μ1)、无载体对照组(灭菌超纯水10μ1+感受态Dffia200μ1)。(含Amp50yg/ml)中,37°C水浴振摇培养过夜,次日按常规方法提取重组质粒,然后用ΒοI单酶切、BamHI和ΒοI双酶切鉴定该重组质粒,其酶切体系如下