文档介绍：《细胞工程原理与技术》实验计划
实验班级:07级
指导老师:魏海明吕新怀郑晓东张晓龙金晶
实验室负责人:吕新怀******@., 3600453
实验1 HL-60细胞的培养、传代、复苏和冻存
1、HL-60细胞的培养与传代(第一周)
实验分组
83_人分3大组进入万级净化细胞间,每大组 27,27,29 人,分 9 个小组,每小组 3 人,实验材料准备及实验操作以小组为单位。
实验材料
HL-60细胞,无菌完全RPMI-1640培养液,无菌离心管,无菌吸管,无菌培养瓶,离心机,倒置显微镜,超净工作台,CO2培养箱等。
实验方法
HL-60细胞为悬浮细胞生长的细胞,可在完全RPMI-1640培养液中培养,该培养液由90%不完全1640培养液[RPMI-1640液95毫升;***酸钠1毫升;*** 1毫升;1M Hepes 1毫升;% NaHCO3 1毫升;青霉素、链霉素(各1万单位) 1毫升]和10%灭活胎牛或新生牛血清。传代时不必采用酶消化法,而可直接传代或离心收集细胞后传代。通常采用离心方法传代,即将细胞连同培养液一起转移到离心管内,离心800rpm×5min, 然后去除上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打使之形成细胞悬液,然后传代接种。根据细胞数量,可采用1瓶传3瓶或其它比例传代。
2 HL-60细胞的冻存(第一周)
原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。为了避免污染造成的损失,最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化,需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前,细胞应该特性化并检查是否污染。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。
试剂和器材
器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管)、离心管、吸管、离心机等。
试剂:%胰酶、RPMI-1640培养基、含保护剂的培养基(即冻存液)。
冻存液配制
培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4
℃下保存。有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基,成分可能如下:
*包含10%甘油的完全培养基,
*包含10%二***亚砜(DMSO)的完全培养基,
*50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基,或
*50% 细胞条件培养基和50%含有10%二***亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基,一些普通的培养基成分可能是:
*50%细胞条件无血清培养基和50%%二***亚砜的新鲜无血清培养基或
*%二***亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
方法与步骤
消化细胞(贴壁细胞),将细胞悬液收集至离心管中。
1000 rpm离心10分钟,弃上清液。
沉淀加含