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了解碱法提取质粒的原理;
掌握碱法提取质粒的方法;
掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
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实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
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结构的三大要素:
多克隆位点
选择标记(耐药性,LacZ)
独立的复制单位
种类:
质粒
噬菌体
酵母人工染色体(YAC)
反转录病毒载体
表达载体等
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pET-32aVector
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pET-32cloning/expressionregion
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Vector(pET-32a)
Genefragment(SmPR10)
pET-32a-SmPR10
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质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液()中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开,而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时,在高盐浓度的情况下,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀;不同的是,质粒DNA复性迅速而准确,保持可溶状态而留在上清中。这样,通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚***仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到较纯的质粒DNA。
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实验仪器、材料与试剂
(一)仪器
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