基因工程大分子的分离与分析.pptx

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Isolation,detectionandpurificationofDNA
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Minipreparation
①principle
Underalkalinecondition,linearDNAdenatureandformprecipitatewithcellcomponents,butplasmidDNAkeepcircular,re-natureunderhighconcentrationofsalttoretaininthesupernatant.
②Steps
cellgrowth
harvestandlysis
plasmidDNApurification(phenol/chloroform,
gradientcentrifugation)
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SolITris-HCl,EDTA,Glucose
SolIINaOH-SDS
SolIII3MKAc
EDTA:Mg2+,DNaseinhibitor
SDS:resolvemembraneproteinandlipidtobreakcellmembrane;resolvenuclearmembraneandnucleosometoreleasenucleicacid;partiallyinhibitRNaseandDNase;denatureprotein.
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DNAelectrophoresis
Size,concentration
Agarosegel
Agarose:atypeofpolymer
Normalmeltingpoint(65℃)
Lowmeltingpoint(25℃20-30℃)
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voltage
mobilityvoltage
2kb5U/cm
electricfieldNegative→positive
pulsfieldforoverhundredsofkbs
%4℃-30℃
lowmeltingpoint4℃
bufferTAETBETPE50mM(~)
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Alkalineagaroseelectrophoresis
forssDNAorSouthernblot
loadingbuffer
溴酚蓝/二甲苯菁FF40%Sucrose
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Polyacrylamidegelelectropholesis(PAGE)
Advantages:highresolution(1bp)
largesampleloading(10g)
highpurityofrecoveredsample
Non-denature:
mobility(sequenceandcomposition)
Denature(尿素/甲醛):
isolateprobe
analyzetheproductsofenzymeS1
DNAsequencing
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PurificationofDNAfragment
(fromagarose)
Lowmeltingpointagarose
gel+5voltris65℃5minphenolextractethanol
Permeationbag(electricalelution)
for5kb
GlassMilk(bead)
3MNaI,beadattachmentelute
Kit
Qiagencorp.
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