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专利名称:管状蠕虫溶菌酶及其制备方法
技术领域:
本发明涉及一种溶菌酶,尤其是涉及一种管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶及其制备方法。深海热液区管状蠕虫Ridgeiapiscesae两种溶菌酶基因IysA和lysB,特别是涉及两种溶菌酶及其制备方法。
背景技术:
溶菌酶()是水解酶的一种,又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,广泛分布于自然界的各种生物中,它是一种碱性球蛋白,通过水解微生物细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖***之间的β-1,4-糖苷键,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,从而引起细菌的裂解。目前,已发现的溶菌酶可分为六类鸡蛋卵清(c)型、鹅卵清(g)型、细菌型、植物型、噬菌体型、无脊椎动物⑴型。研究发现,除了革兰氏阳性菌以外,一些溶菌酶对革兰氏阴性菌也有作用,抗原生生物、抗真菌活性也有报道;溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活;此外,溶菌酶还参与机体内多种免疫反应,在机体正常防御和非特异性免疫中具有重要作用。因此溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒、增强机体免疫力等作用,其在食品、医药、农业等领域都有着广泛的应用
(1、丁亦男,(自然科学版)·2009,28(6):46-47)。深海热液区是地球上典型的极端环境,具有高压、黑暗、高毒(重金属、硫等)等特点,条件极其严酷。但以管状蠕虫等为代表的生物与化能自养微生物形成了独特的共生体系,共同支撑起了这里庞大的生态系统。在这样特殊的环境里,共生体系形成了独特的遗传结构、生物功能和代谢机制,共同抵御周围的极端环境;而在代谢中形成的各种特殊活性物质,包括解毒、抗菌、抗病毒、抗癌物和酶类等,与陆地资源相比将更具特殊性,是极具潜在应用价值的资源。
发明内容
本发明的第一个目的是提供管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶基因。本发明的第二个目的是提供管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶。本发明的第三个目的是提供一种所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶的制备方法。本发明所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶基因为管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶IysA基因或管状螺虫Ridgeiapiscesae溶菌酶IysB基因;所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶IysA基因的分子类型为DNA;序列特征为长度729bp,类型核酸,链性双链,拓扑结构线性;其序列()如下所示1ATGCGAGGGTTCCTCGTGATMGTTTGTCGGCGGCACTTGTCTGTCTTGGGGGGCTGGAC61GTCACCACTGCAGACGCGMATGTCTCCAGCGAGGCGGCAAGTGCCAGTACACGTTCM
C
121TACTGCACTGGTGCCTTCTGGTCCGGCTACTGCTACGGGGCTAGTMCAGACGCTGCTGC
181ATTCCTGGCAGCMGTCGGGAGACTCMGTTGCATAMGAMGGTGGCCACTGCATGGAC
241GACAGGACCAACAGTTGTGACGGCMCTACCAGTCAGGCTACTGCTCCGGCMCTCTCAC
301CGCCGATGCTGCATTGMGGMGCGGAGGAGGACGAMCAGCGGAGGCTCCGGAGGATTC
361TTAGTCGAGTGCATGMCTGCATATGTGAGATCGAGGGATGTAGCAGGMTTTGGGCMG
421TGCAGAGACGACMGGGATCAGACAGCTGTGGACCATTCCAMTTMGTCACCCTACTAC
481ACGGACTGCTACMGCCGGGCTCAGATTGGCGMGCTGTACTMGCAMTGGGCTGCTCG
541MGATTTGCGTTGTTGCCTACATGCGTCGCTATGGCMCCGCTGCGCCCGCATGGCTGGT
601CGTAGCCMGCMCGTGTCAAGACTTCGCCCGTGTTCACAATGGCGGACCGAMGGTTGC
661TTCAGGACCAGCACCTTGGACTACTGGAMMGATACTCTCTTGCTGCGTCCGGGTGGGC
721GGATGTTAA
所述I『状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶IysB基因的分子类型为DNA;序列特征为长度:720bp,类型核酸,链性双链,拓扑结构线性;其序列()如下所示
1ATGCGAGGGTTCCTCGTGATTAGTTTGTCGGTGGCACTTGTCTGTCTAGGGTGGCTGGAC
61GTCACCACTGCAGACCAGMGTGTCACCMCGAGGCGGTACGTGCCAGTACACGTCCMC
121TCTTGCAGCGGGGCCTATTGGMGGGCTACTGCMTGGCGCTAGTMCAGGCGCTGCTGC
181ATTCCTGGCAACATGTCTGGAGACTCMGTTGCATAMGAMGGTGGCCACTGCATGGAC
241GACAGGACCAACAGTTGTGACGGCMCTACGAGTCAGGCCACTGCTCCGGCMCTCTCAC
301CGCAGATGCTGCATTGGAGGAGGCGGAMCAGCGGAGGCACTACAGGATTTTCAGATGCC
361TGCTTGMCTGCATATGTGAGATCGAGGGATGTGAGMTAACGTGGGCMGTGCMTTGG
421GACGTCMCTCAGACAGCTGCGGACCGTTCCAMTTMGGATGTTTACTACACAGACTGC
481TACMGCCGGGCACMGCTGGCGTAGCTGTGCGAMGAMTGGCCTGCTCGMGACTTGC
541GTTCGTGCCTACATGCGTCGTTGGGGCCCCAGCTGCGCCCGCMGGCAGGTCGTAGCCAG
601GCMCGTGCCMGACTACGCCCGTGTCCACMTGGCGGACCGAGTGGATGCATMGGTCC
661TATACCCTGGGATACTGGMMGGATTAGCGCTTGCTGCGACAGGGTGGGCGGATGTTMo
所述,￥状螺虫Ridgeiapiscesae溶菌酶IysA基因和管状螺虫Ridgeiapiscesae
溶菌酶IysB基因的核苷酸序列采用以下方法获得提取管状蠕虫Ridgeiapiscesae的RNA,并将RNA反转录成cDNA,进一步以cDNA为模板,,,,。然后通过重组表达IysA和IysB基因,纯化IysA和IysB基因的表达产物,生物学方法证明IysA和IysB基因编码的多肽()具有溶菌酶活性;;;;。本发明所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶为管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶LysA或管状螺虫Ridgeiapiscesae溶菌酶LysB;
所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶LysA的分子类型为蛋白质;序列特征长
度为242aa,类型为氨基酸;序列()如下所示1MRGFLVISLSMLVCLGGLDVTTADAKCLQRGGKCQYTFNYCTGAFffSGYCYGASNRRCC61IPGSKSGDSSCIKKGGHCMDDRTNSCDGNYQSGYCSGNSHRRCCIEGSGGGRNSGGSGGF121LVECMNCICEIEGCSRNLGKCRDDKGSDSCGPFQIKSPYYTDCYKPGSDffRSCTKQMGCS181KICVVAYMRRYGNRCARMAGRSQATCQDFARVHNGGPKGCFRTSTLDYWKKILSCCVRVG241GC;所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶LysB的分子类型为蛋白质;序列特征长度为239aa,类型为氨基酸;序列()如下所示1MRGFLVISLSVALVCLGffLDVTTADQKCHQRGGTCQYTSNSCSGAYWKGYCNGASNRRCC61IPGNMSGDSSCIKKGGHCMDDRTNSCDGNYESGHCSGNSHRRCCIGGGGNSGGTTGFSDA121CLNCICEIEGCENNVGKCNffDVNSDSCGPFQIKDVYYTDCYKPGTSffRSCAKEMACSKTC181VRAYMRRffGPSCARKAGRSQATCQDYARVHNGGPSGCIRSYTLGYWKRISACCDRVGGC。;、缺失或添加而形成的,。本发明所述管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶的制备方法,包括以下步骤1)管状蠕虫RidgeiapiscesaeRNA的提取;2)
管状蠕虫RidgeiapiscesaecDNA反转录;3)管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶基因的PCR扩增和序列分析;4)管状蠕虫Ridgeiapiscesae溶菌酶基因的表达和纯化。本发明通过提取管状蠕虫Ridgeiapiscesae的RNA,从中克隆和鉴定了溶菌酶IysA和IysB基因,并在大肠杆菌工程菌中进行重组表达,从而对重组酶进行了纯化以及性质测定,为该酶的实际应用提供了基础。两种基因所编码的溶菌酶LysA和LysB能够在大肠杆菌中稳定表达,并且纯化后的酶纯度高、活力好,可以克服管状蠕虫不易采集,分离纯化酶的过程复杂繁琐等不足。该酶能广泛应用于生物、食品、医药、农业等研究领域。
图1为LysA和LysB重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。在图1中,a=LysA和LysB重组表达的SDS-PAGE图谱。1蛋白Marker;2重组载体pGEX-4T-2_LysA在菌株BL21的未诱导表达;3重组载体pGEX-4T-2-LysA在菌株BL21的诱导表达;4重组载体pGEX-4T-2-LysB在菌株BL21的未诱导表达;3重组载体pGEX-4T-2_LysB在菌株BL21的诱导表达。b=LysA和LysB表达纯化的SDS-PAGE图谱。1蛋白Marker;2经GST介质纯化所得的目的蛋白LysB;3经GST介质纯化所得的目的蛋白LysA。图2为LysA和LysB的溶菌酶活性测定图谱。在图2中,横坐标为反应时间Reactiontime(min),il^fe^jOD%450nm^n^j^jfAbsorbanceat450nm;ffi^aTimevsGST,
曲线b为TimevsLysA,曲线c为TimevsLysB0图3为LysA和LysB的异肽酶活性测定图谱。在图3中,横坐标为反应时间
6Reactiontime(min),il^fe^jOD%405nm^n^j^jfAbsorbanceat405nm;ffi^aTimevsLysA,曲线b为TimevsLysB,曲线c为TimevsGST。图4为温度对重组酶LysA和LysB的影响图谱。在图4中,横坐标为温度Temperature(°C),纵坐标为异肽酶活性Relativeactivity);曲线a为LysA,曲线b为LysB0图5为pH对重组酶LysA和LysB的影响图谱。在图5中,横坐标为pH,纵坐标为异肽酶活性Relativeactivity(%);曲线a为LysA,曲线b为LysB。
具体实施例方式下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(2、萨姆布鲁克,拉塞尔(著),黄培堂(译),分子克隆实验指南,北京科学出版社,2002年,第三版.)中所述的实验条件,或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。为实现上述目的,本发明采用以下技术措施,,加入ImLTRIReagent(MRC公司),用电动勻浆机彻底分散组织,室温静置
5min裂解细胞;***仿,剧烈振荡15s,室温静置IOmin;4°C,12000g离心15min;将上层液体转移至一新的离心管中,,混勻,室温放置IOmin;4°C,12000g离心IOmin;倒去液体,加入ImL75%乙醇漂洗;4°C,7500g离心5min;倒去液体,RNA沉淀稍加干燥后溶于适量的DEPC处理过的水中;用紫外分光光度计测量总RNA在OD23tl,OD26tl,OD28tl的吸光度,判定总RNA的浓度与纯度。,包括2μg总RNA,1μLOligo(dT)20(50μΜ),1μLdNTP(IOmM),用DEPC处理过的H2O将总体积补至13μL;反应体系65°C处理5min,立即放入冰浴中Imin;稍离心,加入下列组分:4μL5XFirst-StrandBuffer,1μLDTT(),1μLRNaseInhibitor(40U/μL)(TaKaRa公司)禾口1μLSuperScriptTMIIIreversetranscriptase(200U/μL)(Invitrogen公司);反应体系轻弹混勻,稍离心;50°C温育60min;70°C处理15min终止反应。,用引物AF和AR与BF和BR分别扩增溶菌酶IysA和IysB基因(不含有信号肽)。AFGGATCCAAATGTCTCCAGCGAGGCGGCA();ARGAATTCTTAACATCCGCCCACCCGGA()
;BFGGATCCGACCAGAAGTGTCACCAACG();BRGAATTCTTAACATCCGCCCACCCTGTC();划线部分GGATCC代表BamHI酶切位点,GAATTC代表EcoRI酶切位点。在50μ1的反应体系中含2μL模板,1μL引物AF(或BF)(10μM),1μL引物AR(或BR)(10yM),4yLdNTP(),10μL5XPrimerSTARBuffer,1μLPrimerSTARtmHSDNAPolymerase()(TaKARa公司),用H2O将总体积补至50μL。PCR反应条件为98°C10s、68°Clmin、68°C7min(30cycles);4°C保存。PCR产物经纯化后与T载体连接,转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中,挑取有插入DN***段的阳性克隆测序。根据得到的核苷酸序列推导出的LysA和LysB的氨基酸序列,分别为242和239个氨基酸残基,。,胶回收IysA和IysB基因片段,同时将质粒PGEX-4T-2也用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜(1216h)。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,提取质粒,测序验证。将含有IysA和IysB基因的重组表达质粒pGEX-4T-2-LysA和pGEX-4T-2_LySB分别转化大肠杆菌BL21,选取阳性克隆在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中