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文档介绍:该【窖泥细菌的鉴定方法 】是由【421989820】上传分享,文档一共【10】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【窖泥细菌的鉴定方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。窖泥细菌的鉴定方法
专利名称:窖泥细菌的鉴定方法
技术领域:
本发明属于微生物领域,具体涉及窖泥细菌的鉴定方法。
背景技术:
窖泥微生态系统是由厌氧异养菌、甲烷菌、已酸菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌和***盐还原菌等多种微生物组成的共生群落系统。“百年老窖”其实质是窖泥中富集了大量以细菌为主的多种微生物菌群,经过长期不断的驯化及代谢产物的积累,产生了以已酸乙酯为主体的香气成分,为浓香型白酒带来了独特风味。窖泥质量的好坏直接对酒质起关键性作用,因此窖泥微生态系统中的微生物的选育及鉴定,对新窖老熟及进一步培养出优质窖泥,提高浓香型白酒的产量和质量提供技术支撑。·
MicroStation快速微生物鉴定仪,可鉴定超过2000种好氧菌、厌氧菌和酵母菌,还可以进行霉菌的鉴定。该系统为美国FDA认可,适用于任何规模的实验室中,由于使用了方便的读数仪,非常节省劳动力。自Biolog全自动微生物鉴定仪问世以来,在微生物的鉴定上发挥了重大作用。该仪器的原理是利用固定在微孔板上的不同生化试验(检测待鉴定微生物对众多碳源的利用情况)对微生物提供表型概况并进行鉴定,Biolog鉴定系统MicroStation中的软件通过读取微孔板上所表现出的
“表型指纹”被用来在种的水平上鉴定该微生物。采用Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定时,纯的培养物是鉴定的前提。在鉴定中最普遍的问题是技术人员可能没有意识到他们获得的并非纯的培养物,而是混合培养物。如果需要鉴定的微生物不纯,而该系统本身无提示性,且系统仍然把它当纯种微生物对待,根据碳源的利用情况来判别就会给出错误的鉴定结果。窖泥中很多细菌能分泌粘液,具有粘性的表面,它们很容易和其它细菌紧紧的黏在一起,而窖泥中细菌种类繁多,通过一般的分离纯化得到纯的单菌株非常困难。白酒业是中国传统产业,酿酒窖池中窖泥细菌的分离鉴定对于揭秘中国传统白酒微量香味物质生成机理具有重大的现实意义。所以寻找一种快速、准确鉴定窖泥细菌的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种窖泥细菌的鉴定方法。本发明的技术方案是窖泥细菌的鉴定方法,包括如下步骤I)获得待测菌株无菌条件下,取窖泥于含有玻璃珠的灭菌水中,ISOrpm室温振荡30分钟,按10倍的梯度将菌液稀释到10_6,取各稀释度的菌液接种到分离培养基中,37°C厌氧培养57天,得到单菌落;2)验证待测菌株是否为纯化菌株提取待测菌株的基因组DNA,扩增16srDNA,将扩增结果测序,若测序结果没有重叠峰,即得到纯化的待测菌株,若测序结果有重叠峰,即进行二次纯化,得到纯的培养物;扩增引
物的序列如SEQIDNoI和SEQIDNo2所示;3)采用Biolog全自动微生物鉴定仪对纯的细菌菌株进行鉴定。
其中,步骤I)中分离培养基配方如下基础培养基850mL/L,维生素溶液5mL/L,;121°C高压灭菌20min,冷却至65°C,加入2%无水乙醇。其中,所述基础培养基配方如下=KH2PO4L5g/L,(NH4),,,,,,FeCl2·,CoCl2·,MnCl2·。其中,,,,,;滤膜过滤,_20°C保存。在分离培养基中添加维生素溶液能给很多难于培养的厌氧微生物带来微量营养物质,使它们生长或是更好的生长,这样分离效果更好。其中,步骤2)所述的二次纯化包括如下操作无菌条件下,接种待纯化菌株于含有玻珠的灭菌水中,180rpm室温振荡30分钟,按10倍的梯度将菌液稀释到10_6,取各稀释度的菌液接种到二次纯化培养基中,37°C厌氧培养57天,得到单菌落;所述二次纯化培养基为在分离培养基中添加20%的窖泥浸出液和5%的脱脂羊血得到。其中,所述的窖泥浸出液的制备方法如下取20年以上窖龄的窖底泥,加水,小火煮30min,过滤,定容;定容比例为每
50g窖底泥定容至1L。本发明方法鉴定结果准确可靠。在使用Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定前,对待测菌株进行纯化鉴定,以保证鉴定结果的准确性。本发明方法还针对窖泥细菌的特点,提出了专用的分离培养基,辅助提高鉴定效果。本发明为窖泥细菌的鉴定提供了新的选择,在酿酒领域具有重要的应用价值。
图I、16srDNA扩增的琼脂糖电泳图,图中M代表Marker(康为世纪公司,DM2000)
图2、I号单菌落的16srDNA扩增后测序峰3、2号单菌落的16srDNA扩增后测序峰4、3号单菌落的16srDNA扩增后测序峰5、4号单菌落的16srDNA扩增后测序峰图
具体实施例方式本发明的窖泥细菌的鉴定方法,包括如下步骤I)获得待测菌株无菌条件下,取窖泥于含有玻璃珠(其作用是为了有利于窖泥分散,使菌株从窖泥中溶到水中,玻璃珠的直径约5mm)的灭菌水中,180rpm室温振荡30分钟,按10倍的梯度将菌液稀释到10_6,取各稀释度的菌液接种到分离培养基中,37°C厌氧培养57天,得到单菌落;2)验证待测菌株是否为纯化菌株提取待测菌株的基因组DNA,扩增16srDNA,将扩增结果测序,若测序结果没有重叠峰,即得到纯化的待测菌株,若测序结果有重叠峰,即进行二次纯化,得到纯的培养物;扩增引物为27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQIDNol)和1492RGGTTACCTTGTTACGACTT(SEQIDNo2)。在
DNA测序过程中,测定的是每一个碱基。DNA分子的每一位点对应一个碱基,这是通过测序仪器测定的每一峰值来确定该位点为何种碱基。若同一位点对应多个峰或者有交叉,即为重叠峰,则说明待测样品中的DNA分子不纯,从而导致同一位点测出多种碱基的峰值。在细菌中16srDNA高度保守,若出现重叠峰则说明所扩增出来的16srDNA不纯,可能来自非同一菌株。3)采用Biolog全自动微生物鉴定仪对纯的细菌菌株进行鉴定。其中,步骤I)中分离培养基配方如下基础培养基850mL/L,维生素溶液5mL/L,;121°C高压灭菌20min,冷却至65°C,加入2%无水乙醇。其中,所述基础培养基配方如下=KH2PO4L5g/L,(NH4),,,,,,FeCl2·,CoCl2·,MnCl2·。本发明中,根据窖泥细菌的特点,经过多次实验,得到了现有的针对窖泥细菌分离的基础培养基的配方。其中,,,,,;滤膜过滤,_20°C保存。在分离培养基中添加维生素溶液能给很多难于培养的厌氧微生物带来微量营养物质,使它们生长或是更好的生长,这样分离效果更好。其中,步骤2)所述的二次纯化包括如下操作无菌条件下,接种待纯化菌株于含有玻珠的灭菌水中,
180rpm室温振荡30分钟,按10倍的梯度将菌液稀释到106,取各稀释度的菌液接种到二次纯化培养基中,37°C厌氧培养57天,得到单菌落;所述二次纯化培养基为在分离培养基中添加20%的窖泥浸出液和5%的脱脂羊血得到。其中,所述的窖泥浸出液的制备方法如下取20年以上窖龄的窖底泥,加水,小火煮30min,过滤,定容;定容比例为每50g窖底泥定容至1L。因窖泥浸出液中富含大量适合窖泥细菌生长微量因子,适量加入有利于微生物的生长,可促进微生物的分离。
实施例I、获得待鉴定菌株无菌条件下取10克窖泥于装有90mL无菌水并放有玻珠的250mL三角瓶中,置摇床上180rpm室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10_6,取各稀释度菌液ImL放入无菌平皿中,倒入灭菌后冷却至50°C的分离培养基,混匀,待凝固后放入37°C厌氧培养箱培养57天,挑取平皿中单菌落备用。选取4个待鉴定单菌落用于后续鉴定,编号1、2、
3、4。所使用的分类培养基配方基础培养基850mL/L(KH2PO4L5g/L,(NH4),,,,,,·002g/L,,),维生素溶液5mL/L(,,,
,;滤膜过滤),;121°C高压灭菌20min,冷却至65°C,加入2%无水乙醇。2、验证待测菌株是否为纯化菌株(I)待测菌株总DNA提取,使用TIANGENBIOTECH的DNA提取试剂盒(货号DP302,下述用到试剂都是该试剂盒中提供的)·
I)菌液制备挑取单菌落于相应的液体窖泥细菌筛选培养基(5ml/试管)中,放入3537°C厌氧恒温培养f2天。待菌液浑浊,则可用于基因组DNA的提取。。2)取细菌培养液约5ml,IOOOOrpm离心lmin,尽量吸净上清。3)向菌体沉淀中加入200uL缓冲液GA,振荡至菌体彻底悬浮。4)向管中加入20uL蛋白酶K溶液,混匀。5)加入220uL缓冲液GB,振荡15s,70°C放置lOmin,溶液变清亮,简短离心以去除
管盖内壁的水珠。6)加220uL无水乙醇,充分振荡混匀15s,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以
去除管盖内壁的水珠。7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm离心30s,倒掉非也,将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液⑶,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。9)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。10)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
11)将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加5(T200ul洗脱缓冲液TE,室温放置25min,12000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中,
4°C保存。13)%的琼脂糖凝胶电泳检测。首先用IXTAE(配方如下Trisbase40mM/L>Aceticacidglacial20mM/L>EDTAImM/L)配制1%的琼脂糖凝胶,加热溶解,待冷却至5(T60°C时倒入胶模板中,使凝胶聚合。然后将4μL样品与IμL加样缓冲液混匀后,注入加样孔中。电泳缓冲液为1ΧΤΑΕ,电压160V,电泳时间40min。电泳结束后将胶放在EB()中染色约lOmin。采用SyngeneG:BoxHRGelDocumentation凝胶成相系统拍照。(2)目的片段(16srDNA)PCR扩增I)扩增引物用细菌通用引物27f_1492r,具体序列如下27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQIDNoI)1492RGGTTACCTTGTTACGACTT(SEQIDNo2)2)反应体系(50uL)见表I。表I反应体系
H3允许的最终浓度范围~
无菌超纯水-
~10XPCRBuffer~6μΤ
权利要求
,其特征在于包括如下步骤O获得待测菌株无菌条件下,取窖泥于含有玻璃珠的灭菌水中,ISOrpm室温振荡30分钟,按10倍的梯度将菌液稀释到10_6,取各稀释度的菌液接种到分离培养基中,37°C厌氧培养57天,得到单菌落;2)验证待测菌株是否为纯化菌株;提取待测菌株的基因组DNA,扩增16srDNA,将扩增结果测序,若测序结果没有重叠峰,即得到纯化的待测菌株,若测序结果有重叠峰,即进行二次纯化,得到纯的培养物;扩增引物的序列如SEQIDNoI和SEQIDNo2所示;3)采用Biolog全自动微生物鉴定仪对纯的细菌菌株进行鉴定。
,其特征在于步骤I)中分离培养基配方如下基础培养基850mL/L,维生素溶液5mL/L,;121°C高压灭菌20min,冷却至65°C,加入2%无水乙醇。
,其特征在于所述基础培养基配方如下=KH2PO4L5g/L,(NH4),,,,,,FeCl2·,CoCl2·,MnCl2·。
,其特征在于所述维生素溶液的配方如下四氨基苯甲酸酯
,,,,;滤膜过滤,_20°C保存。
,其特征在于步骤2)所述的二次纯化包括如下操作无菌条件下,接种待纯化菌株于含有玻珠的灭菌水中,ISOrpm室温振荡30分钟,按10倍的梯度将菌液稀释到10_6,取各稀释度的菌液接种到二次纯化培养基中,37°C厌氧培养57天,得到单菌落;所述二次纯化培养基为在分离培养基中添加20%的窖泥浸出液和35%的脱脂羊血得到。
,其特征在于取20年以上窖龄的窖底泥,加水,小火煮30min,过滤,定容;定容比例为每50g窖底泥定容至1L。
全文摘要
本发明属于微生物领域,具体涉及窖泥细菌的鉴定方法。本发明要解决的技术问题是提供一种窖泥细菌的鉴定方法。本发明的技术方案是窖泥细菌的鉴定方法,包括如下步骤1)获得待测菌株;2)验证待测菌株是否为纯化菌株;3)采用Biolog全自动微生物鉴定仪对纯的细菌菌株进行鉴定。本发明方法鉴定结果准确可靠,为窖泥细菌的鉴定提供了新的选择,在酿酒领域具有重要的应用价值。