文档介绍：该【禽肺炎病毒的lamp检测试剂盒的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【16】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【禽肺炎病毒的lamp检测试剂盒的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。禽肺炎病毒的lamp检测试剂盒的制作方法
专利名称:禽肺炎病毒的lamp检测试剂盒的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒。
背景技术:
禽肺炎病毒(Avianpneumovirus,APV)是禽偏肺炎病毒属的成员,属于禽副黏病毒科。该病毒主要危害火鸡和不同品种的鸡,包括种鸡、商品***和鸡蛋,发病日龄一般在4一7周龄,5—6周龄为发病高峰,主要引起上呼吸道的症状,以喷嚏,眼结膜潮红,泪腺肿,头部出现皮下水肿,俗称肿头;产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2%—40%,孵化率降低;随着病情的发展,还表现出神经症状;该病引起的发病率在1%—90%之间,引起鸡死亡率在1%—20%,在发病期间继发其它疾病的感染,会引起更大的死亡,造成对养禽业尤其是种禽的极大危害。目前,检测禽肺炎病毒的方法有病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术(IFA)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Genechips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便,但耗时太长,通常需要两天到一周的时间;IFA、ELISA快速但需要特殊试剂;RT-PCR、RRT-PCR、Genechips检测技术快速、灵敏,但都需要特殊仪器和技术人员,且成本较高,不适合在基层推广使用。环介导等温基因扩增技术
(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的链置换DNA聚合酶(即BstDNA聚合酶),在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应,整个反应不需要特殊的仪器设备,仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计针对6个特异区域的4条引物(内引物两条分别为FIP和BIP、外引物两条分别为F3和B3),为了进一步提高反应的特异性,还可设计两条环引物;LAMP反应结果的观察方法非常简便,反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势,尤其适合在基层检测应用。在LAMP技术中,引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增引物组。本发明所提供的弓丨物组包括弓丨物I、引物2、引物3和引物4;所述引物I的核苷酸序列如序列表序列I所示所述引物2的核苷酸序列如序列表序列2所示所述引物3的核苷酸序列如序列表序列3所示所述引物4的核苷酸序列如序列表序列4所示。在上述引物组中,还包括引物5和引物6;所述引物5的核苷酸序列如序列表序列5所示;所述引物6的核苷酸序列如序列表序列6所示;在上述引物组中,所述引物组具体由所述引物
I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。在上述引物组中,所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为(15-17):(15-17):(-):(-):(-):(-);具体可为16:16:8:8:8:8。本发明的另一个目的是提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂。本发明所提供的环介导等温基因扩增试剂由上述任一所述的引物组、环介导等温基因扩增缓冲液、链置换DNA聚合酶(即BstDNA聚合酶)、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、***化锰和水组成。在上述试剂中,所述引物组中的所述引物I在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15μmol/μL一17μmol/μL;具体可为16μmol/μL;所述引物组中的所述引物2在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15μmol/μL—17μmol/μL;具体可为16μmol/μL;—;具体可为8μmol/μL;—;具体可为8μmol/μL;所述引物组中的所述引物5在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为
—;具体可为8μmol/μL
;所述引物组中的所述引物6在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为
—;具体可为8μmol/μL。在上述试剂中,所述链置换DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、***、、2mmol/L、lmol/L、25μmol/L、。本发明的还提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括上述任一所述引物组或所述环介导等温基因扩增试剂。本发明保护上述任一所述的引物组或所述环介导等温基因扩增试剂或所述环介导等温基因扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒产品中的应用。在上述应用中,所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒包括用上述任一所述引物组或所述环介导等温基因扩增试剂或所述环介导等温基因扩增试剂盒对所述待测样品进行环介导等温基因扩增反应的步骤。本发明针对禽肺炎病毒F基因保守序列设计了六条特异的LAMP引物组,利用该引物组进行LAMP检测可特异检出禽肺炎病毒,最低检出限为IOOfg/μL,其敏感性为常规RT-PCR的100倍。本发明具有检测快速且成本低,不需要昂贵的仪器并且操作方法更简单,适于临床快速检测。
图I为本发明禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的特异性检测结果。图
2为本发明禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的敏感性检测结果。
图3为RT-PCR检测禽肺炎病毒的敏感性结果。图4为本发明禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下述实施例中所用的毒株或菌株的信息如下禽肺炎病毒毒株MN2a:,,(2000)139-。鸡新城疫病毒毒株Lasota、禽脑脊髓炎病毒毒株VanRoekel;鸡毒霉形体毒株S6、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株、禽呼肠孤病毒毒株S1133和禽巴氏杆菌菌株C48-1:文献ZhiqinXie(谢志勤)等,ReversetranscriptasepolymerasechainreactiontodetectavianEncephalomyelitisvirus,AvianDisease(美国禽病杂志),2005,49:227-230;谢志勤等,应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒,广西科学,2001,8(2)152-153;公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。实施例
I、禽肺炎病毒的LAMP引物设计及其试剂盒一、引物设计根据禽肺炎病毒(Avianpneumovirus,APV)的F基因(Genbank号AF187154,如序列表序列所示)保守区域,设计并合成如下LAMP引物(方向均为从5’-3’端)内引物I:AGCAGGACAATGAGGACTATCACTA-GTCAAACAAGATATTGGATAGCAC(如序列表序列I所示,横线前序列与序列表序列7的第1515-1491位互补,横线后序列与序列表序列7的第1440-1463位相同);内引物2AGTTGGTGTGGGTGTCTTCT—CCATTCATTTCCATTGGGAA(如序列表序列2所示,横线前序列与序列表序列7的第1528-1547位相同,横线后序列与序列表序列7的第1599-1580位互补);外引物I:GCCAGAATCTGATAGACCA(如序列表序列3所示,与序列表序列7的第1422-1440位相同);外引物2:GGATAAATCCTTTGTTGTTCACA(如序列表序列4所示,与序列表序列7的第1622-1560位互补);环引物I:ATGACAAATCCTGCATTCCC(如序列表序列5所示,与序列表序列7的第1491-1472位互补);环引物2TGTGGTTAAGAAGAGAAAAGCTGC(如序列表序列6所不,与序列表序列7的第1549-1572位相同)。二、LAMP鉴别试剂及试剂盒LAMP反应液体系(24μL)(Biolabs公司,产品目录号0360912)、
lyL8U/yLBstDNA聚合酶(Biolabs公司,产品目录号0360912,)、(中国大连宝生物工程公司Takara产品,产品目录号D4030RA,)、2μL25mmol/L硫酸镁(反应体系中的终浓度为2mmol/L)、2μL200μmol/μL的内引物I(反应体系中的终浓度16μπιο1/μL)、2yL200ymol/yL的内引物2(反应体系中的终浓度16μmol/μL)、lμL200μmol/μL的外引物I(反应体系中的终浓度8μmol/μL)、
IμL200μmol/μL的外引物2(反应体系中的终浓度8μmol/μL)、lμL200μmol/μL的环引物I(反应体系中的终浓度8μmol/μL)、lμL200μmol/μL的环引物2(反应体系中的终浓度8μmol/μL),5μL5mol/L甜菜碱(反应体系中的终浓度lmol/L)、lμL625μmol/L钙黄绿素(反应体系中的终浓度25μmol/L)、***化锰()。禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒可包括上述反应液,也可包括分别独立包装的上述引物及试剂。实施例2、LAMP试剂盒的特异性检测一、模板的获得I、病毒RNA提取及cDNA的获得I)病毒RNA提取使用Trizol试剂提取(Invitrogen公司,产品编号为15596-026)按使用说明书,从如下病原体分别感染的鸡胚尿囊液中分别提取RNA(以提取阴性鸡胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品
):禽肺炎病毒毒株MN2a(经测序比对证实为禽肺炎病毒)、鸡马立克氏病毒毒株MDV(南京梅里亚动物保健品公司)、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、禽呼肠孤病毒毒株SI133、鸡新城疫病毒毒株Lasota和禽脑脊髓炎病毒毒株VanRoekel。2)cDNA的获得将步骤I)获得的RNA样品分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录,得到cDNA;以DEPC水作为总RNA的对照。反应体系(10μL):5XReverseTranscriptaseBuffer(反应缓冲液)2μL,RandomPrimer(自由弓I物)(50μmol/μL),dNTPMixture(IOmM)(四种喊基)IμL,RibonucleaseInhibitor(40U/μL)(抑制剂)0·5μL,AMVReverseTranscriptase(5U/μL)(逆转录酶),模板RNAlμL,DEPC水补足至10μL。上述反转录试剂ReverseTranscriptaseBuffer>RandomPrimer、dNTPMixture、RibonucleaseInhibitor、AMVReverseTranscriptase(均为Takara公司产品,目录号分别为DR100A、D3802、D2313A、D2313A、D2620)。反应条件42°CI小时,95°C5分钟。2、对照病毒基因组DNA的提取使用DNA提取试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司,产品编号DV807A),按照试剂盒说明书,从鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组DNA;从禽巴氏杆菌菌株C48-1和鸡毒霉形体毒株S6的培养物中分别提取基因组
DNA。3、测定核酸含量用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值,得出其浓度与纯度值,并以此控制核酸质量。
二、LAMP扩增反应在实施例I步骤二的24μL反应液体系中分别加入IμL步骤一获得的cDNA样品或DNA样品(模板),按照如下反应程序进行LAMP扩增反应60°C90min,然后80°C5min。三、结果LAMP扩增反应的结果可以通过以下两个方法判断在可见光下直接用肉眼观察颜色变化,阳性结果显示黄绿色,阴性结果显示无色;在紫外线下观察阳性结果显示明亮的绿色荧光,阴性结果显示无颜色。可见光下观察结果如图I所示,I为禽肺炎病毒毒株丽2a株;2为鸡马立克氏病毒毒株MDV;3为鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41;4为鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株;5为禽呼肠孤病毒毒株S1133;6为禽巴氏杆菌菌株C48-1;7为鸡毒霉形体毒株S6;8为鸡新城疫病毒毒株Lasota;9为禽脑脊髓炎病毒毒株VanRoekel;10为阴性对照鸡胚尿囊液。图I的结果表明禽肺炎病毒毒株MN2a株检测结果为阳性,而非禽肺炎病毒对鸡马立克氏病毒毒株MDV、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株、鸡新城疫病毒毒株Lasota、禽呼肠孤病毒毒株S1133、禽巴氏杆菌菌株C48-1、鸡毒霉形体毒株S6、禽脑脊髓炎病毒毒株VanRoekel的检测结果均为阴性。在紫外光下判断,结果与上述可见光判断结果一致。说明引物及检测方法用于检测禽肺炎病毒的特异性高。因此,上述引物及判断标准可用来判断未知样本是否含有禽肺炎病毒。实施例
3、LAMP试剂盒的敏感性检测I、不同浓度RNA样品的制备将实施例2步骤一中I获得的禽肺炎病毒丽2a株的RNA定量后按10倍递增稀释成IOOng/μL、10ng/μL、lng/μL>IOOpg/μL、10pg/μL、lpg/μL>IOOfg/μL>IOfg/μL、lfg/μL02、cDNA的获得将步骤I获得的不同浓度RNA样品分别按照实施例2步骤一中I的2)的方法进行反转录,获得cDNA。3、LAMP扩增及结果取步骤2的cDNA样品分别按照实施例2步骤二的反应体系和反应程序进行LAMP扩增,肉眼可见光下观察结果如图2所示,图中的I为lng/μL;2为lOOpg/μL;3为IOpg/μL;4为Ipg/μL;5为IOOfg/μL;6为IOfg/μL;7为Ifg/μL;其中1-5均为阳性,6-7均为阴性;即实施例I禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的检测限为IOOfg/μL。4、PCR扩增及结果(对照)取步骤2的cDNA样品分别按照如下体系和程序进行PCR扩增,具体如下PCR扩增体系(50μL):10XPCRbuffer5μL,IOmMdNTPs2μL,Taq聚合酶(5U)
,上游引物5’-ATCGGGCAATGGTCAGAAGG-3’(100μmol/μL)IμL,下游引物5’-ACACCGTCATAACAGGCTACCAA-3’(100μmol/μL)IμL,cDNA样品5μL,双蒸水补足至50μL。PCR扩增程序