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显微镜荧光波长详解
显微镜荧光波长详解
人肉眼对光源波长的颜色感觉
红色770-622nm
橙色622~597nm
黄色597~577nm
绿色577~492nm
蓝靛色492~455nm
紫色455~350nm
荧光种类
生产厂家
激发光(nm)发射光(nm)颜色
GFP蛋白
395-495
509
绿色
EGFP蛋白
487
509
绿色
DAPI
358-360
460-461
蓝色
AlexaFluor488
Invitrogen
495
519
绿色
AlexaFluor594
Invitrogen
590
617
红色
FITC
490-495
520-530
黄绿色
罗丹明
565
590
红色
(Rhodamine)
TRITC
550
620
橙红色
(Tetramethyl
Rhodamin
Isothiocyanate,四甲
基异硫***酸罗丹明,
是罗丹明的一种衍
生物之一)
Rhodamine
570
590
橙红色
Red-X(RRX)
TexasRed(TR)
589-595
615
橙红色
常有显微镜滤光片的波长
在激发波长在Ex范围内才能被激发,只有发射光波长大于BA/EM才能被察看到,背景光的波长只有大于DM才能被察看到。红色滤光片G-2A
Ex510-560
DM575
BA590
绿色滤光片B-2A
Ex450-490
DM505
BA520
蓝色滤光片UV-2A
Ex330-380
DM400
BA420
显微镜荧光波长详解
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其余荧光染料介绍
【菁类染料-Cyaninedyes(Cy2,Cy3,Cy5)】
Cy2耦联基团激发波长为
492nm,发光为波长510nm
的绿色可见光。Cy2和FITC使用相
同的滤波片。因为Cy2比FITC在光下更稳固。要防止使用含有磷酸化的苯二***的封片剂,
因为这类抗淬灭剂和
Cy2反响,在染色片储藏后会致使荧光轻微和扩散。
Cy3和Cy5比其
他的荧光团探针要更亮,更稳固,背景更弱。
Cy3耦联基团激发光的最大波长为
550nm,
最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很靠近
TRITC,
在荧光显微镜中,可使用
和TRITC同样的滤波片。
Cy3在氩光灯(514nm
或528nm)下能够被激发出50%的光强,在氦氖灯
(543nm)或许***灯
(546nm)下则约75%。Cy3能够和荧光素一同作双标。
Cy3还能够和Cy5一同在共聚焦显
微镜实验中作多标志。
Cy5耦联基团的激发波长最大
650nm,发光波长最大670nm。在氪
氩灯(647nm)下它们可被激发出
98%的荧光,在氦氖灯下(633nm)为63%。Cy5
能够和很
多其余的荧光基团一同用在多标志的实验中。因为它的最大发射波长在
670nm,Cy5很难
用裸眼察看,并且不可以用***灯作理想的激发。往常察看
Cy5时采纳拥有适合激发光和远红
外检测器的共聚焦显微镜。
在水相封片剂中应该加入抗淬灭剂。
使用传统的表面荧光显微镜
时,不介绍使用Cy5。
【藻红蛋白或藻胆色素蛋白
-Phycoerythrin(PE)
荧光标志二抗】
存在于被称为藻红的多聚微粒中,
位于叶绿素的反响中心,在自然构造中,藻红蛋白汲取光
能,汲取后转变成能量,
供其发育生长。当藻红蛋白被分别和纯化后,其蛋白质变得拥有很
强的荧光,能汲取不一样波长的光,发出亮红色的荧光,此时不再接受任何外来的光,也不可以
转移光能。藻红蛋白
PE的汲取波长范围较广,最大的汲取波长为
566nm,最大的发射波
长为574nm。藻红蛋白作为荧光标志物拥有以下长处:第一拥有强的长波长激发和发射荧
光,可防止来自其余生物资料荧光的扰乱;并且拥有极高的发射量子产率;此外
PE拥有非
常高的水溶性并且与很多生物学或合成资料的多位点稳固交联。
【AminomethylcoumarinAcetate(AMCA)
】
耦联的AMCA汲取光波长最大为
350nm,发荧光则为450nm。关于荧光显微镜来说,AMCA
能够用***灯来激发,用紫外滤板来察看。因为
AMCA的信号相对较弱,单标实验中不介绍
使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围,而和发出长波长荧光的荧
光基团没有或许只有很少的重叠,
所以它最常用于多标志实验中,
比方免疫荧光显微镜和流
式细胞仪。因为人眼不可以很好的检测蓝色荧光,在多标志的实验中,
AMCA耦联的二抗应
当被用于检测大批的抗原。
AMCA和荧光素同样很快淬灭,使用抗淬灭剂能够减少。且由
于肉眼不可以很好的检测
AMCA所激发的蓝色荧光,因此AMCA耦联的二抗更合用于检测大
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量存在的抗原。假如使用在流式细胞仪中,AMCA能够用***灯或许水冷却的氩光灯激发,
因为它们发出的光芒是在光谱的紫外区。
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注:因为察看荧光需要必定波长的激发光,一定依据实验室已有的仪器可发光的波段进行选
择。此外,多标志中对探针色彩划分程度的要求。比如,若丹明红-X(RRX)和德克萨斯红

(TR)
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荧光素的差别就比四***若丹明

(TRITC)

或许

Cy3

的差别显然。假如对敏捷度有更高的要
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求,则

Cy3

和

Cy5

就比其余的荧光团探针要亮。
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西美杰备有全面的二抗现货产品并能供给最完好的二抗产品线。
二抗和底物生产厂商KPL以及前沿抗体生产商ProteinTech

主要二抗品牌为全世界最大的
。针对荧光标志二抗,有FITC、
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TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标志二抗;依据检测物种分,有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛,以及多种
细菌类二抗;此外,还有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不一样种类抗体。
Theroleoffiltersinepi-fluorescencemicroscopy
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在激发波长在Ex范围内才能被激发,只有发射光波长大于
察看到,背景光的波长只有大于DM才能被察看到。

BA/EM

才能被
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AsshowninFigure1,(S/N).
荧光滤色块组表示图。每个滤色块组有一个半透半反镜,一个激发光滤光片,两个发射光滤光片。如前面介绍的,由光源发出的光透过激发光滤光片进入滤色块组,被半透半反镜反射;发射出的荧光透过发射光滤光片进入目镜或相机。在这一组合中,半透半反镜以及左边的发射光滤光片是固定在架子上的,而右边的发射光滤光片则安装在一个能够拆卸的滤片框内。只需松动螺丝,就能够拆下右边的滤片框,而后依据需要,改换半透半反镜。改换时需要注意,不要把固定用的
胶水,涂到半透半反镜上,操作要带手套,防止将指纹留在镜面上。
上述体视镜可搭配3各荧光滤色块,以及一个用于明场察看的无滤片块。观
显微镜荧光波长详解
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察时,可经过拉动杠杆调理滤色块的地点,每一个滤色块配有不一样的表记,便于选择。
Excitationfilter(EX)——激发光
Theexcitationfilteristheopticalelementthatpassesonlythewavelengthoflightnecessaryforexcitationfromtheexcitationlightsource(usuallyamercurylamp),onlytheexcitationwavelengthpassesthroughthefilter,usuallya"bandpassfilter".
Dichroicmirror(DM)
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,allowingallotherwavelengthstopassthrough(Figure3).Dichroicmirrorsusedin
epi-fluorescencemicroscopefilterblocksareplacedina45incidence°angletolight,creatinga"stopband"ofreflectedlightanda"pass
band"
reflected90toward°,lightemanatingfromthespecimenispassedthroughanddirectedtowardtheobserver(orhigh-sensitivitycamera).
Barrierfilters(BA)oremission(EM)filters
,thebarrierfiltertransmitslightofthefluorescencewavelengthwhichpassesthroughthedichroicmirrorwhileblockingallotherlightleakingfromtheexcitationlamp(reflectedfromthespecimenoropticalelements).Thisisnecessarybecausethestrengthofthefluorescentlightisweakerthantheexcitationlightbyafactorofmorethan100,000:.
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Nikon'snoiseterminator
Nikon'sepi-fluorescencemicroscopeshaveaproprietaryNikonopticalelementcalleda"noiseterminator"(onmodelsTE2000andlater).AsshowninFigure1,.
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