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202264411 HebeiMedicalJournal,2022,
.1002-
:··
靶向调控食管癌细胞
circ_0003998miR-1184Eca109
增殖迁移及侵袭的机制研究
、
李超李浩然袁晓刘玉洪
【摘要】目的探讨调控食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法法检
circ_0003998Eca109 qRT-PCR
测食管癌组织与癌旁组织中、的表达量;体外培养人食管癌细胞,、、
circ_0003998miR-1184Eca109si-NCsi-circ_0003998
、、与、与分别转染至细胞;
miR-NCmiR-1184mimicssi-circ_0003998anti-miR-NCsi-circ_0003998anti-miR-1184Eca109
实验与克隆形成实验检测细胞增殖能力;实验检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;双荧
CCK-8Transwell
光素酶报告实验检测与的靶向关系。结果食管癌组织中的表达量高于癌旁组
circ_0003998miR-1184 circ_0003998
织(P),的表达量低于癌旁组织(P);转染或转染后,细胞活
<-1184<-circ_0003998miR-1184mimics
力和划痕愈合率降低(P),细胞克隆形成数和侵袭细胞数减少(P);可靶向调控
<<-1184
的表达;共转染与后,细胞活力和划痕愈合率升高(P),细胞克隆形成数和侵袭
si-circ_0003998anti-miR-1184<
细胞数增多(P)。结论干扰表达可通过靶向而抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭。
< circ_0003998miR-1184
【关键词】食管癌;;;细胞增殖;迁移;侵袭
circ_0003998miR-1184
【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】()
A 1002-7386202211-1625-05
ThemolecularmechanismofcirctargetingmiR-toregulatetheproliferation,migrationandinvasionof
_00039981184
esophagealcancercellsEcainvitroLIChao∗,LIHaoran,YUANXiao,etal.∗DepartmentofThoracicSurgery,
109
AffiliatedHospitalofMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Shandong,Qingdao,China
266000
【Abstract】Objective
Toinvestigatethemolecularmechanismofcirc_0003998targetingmiR-1184toregulatethe
,Methods
proliferationmigrationandinvasionofesophagealcancercellsEca109invitro. TheqRT-PCRwasusedtodetect
theexpressionlevelsofcirc_0003998andmiR-1184inesophagealcancertissuesandpara-
,,,,,
culturedhumanesophagealcancercellsEca109thesi-NCsi-circ_0003998miR-NCmiR-1184mimicssi-circ_0003998and
,,
anti-miR-NCsi-circ_0003998andanti-miR--8assayandclone
,
,
scratchtestwasusedtodetectcellmigrationabilityandthedualluciferasereporterexperimentwasusedtodetectthetargeting
Results
correlationbetweencirc_0003998andmiR-1184. Theexpressionlevelsofcirc_0003998inesophagealcancertissue
(P),,
weresignificantlyhigherthanthoseinpara-canceroustissues<-1184were
(P)
significantlylowerthanthoseinthatinpara-canceroustissues<-circ_0003998ormiR-
,,,
1184mimicsthecellviabilityscratchhealingratethenumberofcellcloneformationandthenumberofinvasivecellswere
(P)
significantlydecreased<--
,,,
transfectionofsi-circ_0003998andanti-miR-1184thecellviabilityscratchhealingratethenumberofcellclonesandthe
(P)Conclusion
numberofinvasivecellsweresignificantlyincreased<. Tointerferewiththeexpressionofcirc_
,
0003998caninhibittheproliferationmigrationandinvasionofesophagealcancercellsbytargetingmiR-1184.
【Keywords】;;;;;
esophagealcancercirc_0003998miR-1184cellproliferationmigrationinvasion
食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一食管鳞状细程还可能作为食管癌早期诊断的潜在生物学标记物
,,
胞癌是其主要组织学类型大部分患者确诊时已处于及分子靶向治疗的潜在靶点[1-4]在骨
,。circ_0003998
晚期且患者预后较差近年来研究表明环状肉瘤组织和细胞中上调表达下调其表达可抑制骨肉
,,RNA,
与食管癌细胞增殖凋亡等生瘤细胞的增殖和侵袭[5]但与食管癌相
(circularRNA,circRNA)、。circ_0003998
物学行为密切相关并可参与食管癌的发生及发展过关研究报道相对较少通过靶基因预测网站预测显示
,。
与存在结合位点研究表明
circ_0003998miR-1184,
项目来源十一五攻关课题面上项目编号在结肠癌组织和细胞中下调表达过表达
:(:08G18)miR-1184,
作者单位山东省青岛市青岛大学医学院附属医院胸外可抑制结肠癌细胞增殖并促进细胞凋亡[6]
:266000 ,
科李超刘玉洪阳光融和医院胸外科李浩然山东省潍坊市人民miR-1184。
(、);();因此本研究主要探讨是否通过靶向调
医院寒亭院区胸外科袁晓,circ_0003998
()控的表达影响食管癌细胞的增殖迁移和侵袭
通讯作者刘玉洪miR-1184、。
: E-mail:lny_******@
河北医药年月第卷第期
1626202264411 HebeiMedicalJournal,2022,
材料与方法以为内参以为内参
1 0003998GAPDH,miR-1184U6,
材料收集年月至年月于青岛采用-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量
20191202052。
大学医学院附属医院接受手术切除术治疗的例食实验检测细胞增殖取各组细
CCK-8:Eca109
管癌患者的癌组织及其相应癌旁组织标本立即置于胞接种于孔板3个孔分别在培养箱培养
,96(5×10/),
液氮中保存均经病理诊断确诊为食管癌其中男时每孔加入溶液于培养箱内
,,2024h10μlCCK-8,37℃
例女例年龄岁平均年龄培养用公司生产的酶联免疫检测仪在
,19;50~68,(±)2h,Bio-Tec
岁患者或其近亲属知情同意本研究符合世界医学波长处检测各孔光密度值值
;,《450nm(OD)。
协会赫尔辛基宣言相关要求克隆形成实验取各组细胞按照每孔
》。 :Eca109
试剂人食管癌细胞购自上海齐一生个的密度接种于孔板于培养箱内培养每
Eca1095006,37℃,
物试剂购自美国反转录试剂与隔更换次培养液当孔板中出现肉眼可见的
;TrizolThermoFisher;2d1,6
荧光定量试剂购自北京天根克隆细胞团后终止培养弃培养液后用多
SYBRGreen;(10d),4%
基质胶购自北京索聚甲醛固定结晶紫染色液染色干
Lipofectamine2000、CCK-8、Matrigel30min,1%30min,
莱宝小室购自美国小燥后拍照统计细胞克隆形成数
;TranswellCorning;circ_0003998,。
分子干扰及其阴性对照实验检测细胞侵袭
RNA(si-circ_0003998)(si- Transwell:40μgMatrigel
寡核苷酸模拟物及基质胶稀释液加入孔径为的小室的上室于培
NC)、miR-1184(miR-1184mimics)8μm,
阴性对照序列特异性养箱内孵育进行包被待基质胶凝固后在
mimicNC(miR-NC)、miR-11845h,Matrigel
寡核苷酸抑制剂及其阴性对照上室中加入不含抗生素与血清的培养基然后
(anti-miR-1184)(anti-400μl,
购自上海吉玛过表达载体加入各组细胞5个下室加
miR-NC);circ_0003998Eca109(2×10/ml)200μl,
及其对照空载体购自入含有胎牛血清且不含抗生素的培养液
(pcDNA-circ_0003998)(pcDNA)10%600μl,
美国兔抗人抗体与小室置于培养箱内培养多聚甲醛固定
Invitrogen;E-cadherin、N-cadherin24h,20min,
二抗购自美国结晶紫染液对上室内的细胞染色于显微
IgGCST。%20min,
方法镜下统计穿膜细胞数
。
细胞转染脂质体转染法对细胞进行划痕实验收集各组细胞5个
: :Eca109(1×10/ml)
转染细胞接种于孔板3个孔不接种于孔板孔用移液枪的枪头垂
:Eca10996(3×10/),6(100μl/),100μl
含血清的培养基分别稀释直于孔板作划痕洗涤划下的细胞加入不含血
si-NC、si-circ_0003998、miR-6,PBS,
与清的培养基继续培养分别拍照后记录划痕宽度
NC、miR-1184mimics、si-circ_0003998anti-miR-NC、24h,
与充分混匀后室温孵育并计算划痕愈合率划痕宽度划痕宽度
si-circ_0003998anti-miR-1184[(0h-24h)/
同时用不含血清的培养基稀释划痕宽度
5min,Lipofectamine0h×100%]。
充分混匀将转染物稀释液与双荧光素酶报告实验检测与
2000, circ_0003998
稀释液充分混匀后室温孵育按照每孔的靶向关系将预测得到包含结
20min,400μlmiR-1184:miR-1184
的密度将其加入孔板的细胞中后将培养基更合位点的片段插入得到野生型
96,6hcirc_0003998pmirGLO
换为含有胎牛血清的完全培养基于培养报告基因载体将靶序列进行突变得
10%DMEM,WT-circ_0003998,
箱内继续培养到突变型载体分别将
48h。MUT-circ_0003998,WT-circ_
实验分组与或
:si-NC、si-circ_0003998、miR-NC、0003998、MUT-circ_0003998miR-NCmiR-1184
与共转染至细胞于培养箱内培养
miR-1184mimics、si-circ_0003998anti-miR-NC、si-mimicsEca109,24h
与分别转染至细后应用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞
circ_0003998anti-miR-1184Eca109Eca109
胞分别记为组组组的荧光素酶活性
,si-NC、si-circ_0003998、miR-NC、。
组组检测蛋白
miR-1184、si-circ_0003998+anti-miR-NC、si- WesternblotE-cadherin、N-cadherin
组表达量收集各组细胞加入蛋白裂解液裂解细
0003998+anti-miR-1184。:Eca109
检测的表达胞后提取细胞总蛋白用蛋白定量试剂盒进行蛋
qRT-PCRcirc_0003998、miR-1184,BCA
水平用试剂提取食管癌组织癌旁组织与各组白定量配制凝胶进行电泳实验每孔
:Trizol、,10%SDS-PAGE,
细胞总应用紫外分光光度计测定蛋白上样量为电泳结束后用的
Eca109RNA,RNA30μg,
浓度反转录合成保存反应按膜进行转膜转膜条件膜置于
,cDNA,4℃。qRT-PCR,:200mA90min,PVDF
照荧光定量试剂盒说明书进行操作含有脱脂牛奶的封闭液中室温封闭分别加入
SYBRGreen,circ_5%2h,
河北医药年月第卷第期
202264411 HebeiMedicalJournal,2022,
表和在食管癌组织中的表达
一抗与内1 circ_0003998miR-1184
E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)nx±s
参抗体稀释液孵育过夜加入=39,■
GAPDH(1∶2000)4℃,类别
circ_0003998miR-1184
二抗稀释液室温孵育用美国癌旁组织
(1∶5000)1h,Bio-Rad ±±
食管癌组织
±±
Bio-Rad,t值
用软件分析各条带灰度值P值
ImageJ。
统计学分析应用统计软件计量资
,蛋白水平降低P蛋白水
料以x±s表示组间比较采用独立样本t检验多组cadherin(<),E-cadherin
■,2,平升高P见图表
间比较采用单因素方差分析P为差异有统计(<)。1,2。
,<
学意义
。
结果
2
和在食管癌组织中的表
circ_0003998miR-1184
达与癌旁组织比较食管癌组织中的
,circ_0003998
表达量升高P的表达量降低P
(<),miR-1184(<
见表
)。1。
干扰表达对食管癌细胞增
circ_0003998Eca109
殖迁移和侵袭的影响与组比较
、 si-NC,si-circ_
组细胞活力和划痕愈合率降低P细
0003998(<),
胞克隆形成数和侵袭细胞数减少P图迁移侵袭相关蛋白表达
(<),N-1 、
表干扰表达对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响nx±s
2 circ_0003998Eca109=39,■
组别值细胞克隆形成数个侵袭细胞数个划痕愈合率蛋白蛋白
circ_0003998OD(450nm)()()(%)E-cadherinN-cadherin
组
si-NC ±±±±±±±
组
si-±±±±±±±
t值
P值
过表达对食管癌细胞增殖迁数和侵袭细胞数减少P蛋白水平
miR-1184Eca109、(<),N-cadherin
移和侵袭的影响与组比较组细降低P蛋白水平升高P
miR-NC,miR-1184(<),E-cadherin(<
胞活力和划痕愈合率降低P细胞克隆形成见表图
(<),)。3,2。
表过表达对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响nx±s
3 miR-1184Eca109=39,■
组别值细胞克隆形成数个侵袭细胞数个划痕愈合率蛋白蛋白
miR-1184OD(450nm)()()(%)E-cadherinN-cadherin
组
miR-±±±±±±±
组
miR-±±±±±±±
t值
P值
预测显示与
CircularRNAInteractomecirc_0003998
存在结合位点在细胞中
miR-1184。Eca109,miR-
可抑制携带质粒的荧光
1184mimicsWT-circ_0003998
素酶活性P但当报告质粒携带
(<),MUT-circ_
时未表现明显的抑制作用与组比
0003998。pcDNA
较组的表达量降低
,pcDNA-circ_0003998miR-1184
P与组比较组
(<);si-NC,si-circ_0003998miR-
的表达量升高P见图表
1184(<)。3,4、5。
图迁移侵袭相关蛋白表达
2 、
靶向调控的表达图的序列中含有与互补的核苷酸序列
circ_0003998miR-1184 3 circ_0003998miR-1184
河北医药年月第卷第期
1628202264411 HebeiMedicalJournal,2022,
表双荧光素酶报告实验nx±s
4 =39,■组细胞活力和划痕愈合率升高P
组别+anti-miR-1184(<
WT-circ_0003998MUT-circ_0003998细胞克隆形成数和侵袭细胞数增多P
组
miR-±±),(<
组蛋白水平升高P
miR-±±),N-cadherin(<),E-
t值
P值
(<)。4,6。
表调控的表达nx±s
5 circ_0003998miR-1184=39,■
组别
miR-1184
组
±
组
pcDNA-±∗
组
si-±
组
si-±#
F值
P值
注与组比较P与组比较P
:pcDNA,∗<;si-NC,#<
下调表达逆转了干扰表
miR-1184circ_0003998
达对食管癌细胞增殖迁移和侵袭的作用与
Eca109、
组比较图迁移侵袭相关蛋白表达
si-circ_0003998+anti-miR-NC,si-circ_00039984 、
表下调表达逆转了干扰表达对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用nx±s
6 miR-1184circ_0003998Eca109=39,■
组别值细胞克隆形成数个侵袭细胞数个划痕愈合率蛋白蛋白
miR-1184OD(450nm)()()(%)E-cadherinN-cadherin
组
si-circ_0003998+anti-miR-±±±±±±±
组
si-circ_0003998+anti-miR-±±±±±±±
t值
P值
讨论表达可抑制食管癌细胞迁移及侵袭
3 。
食管癌发病机制尚未阐明探究食管癌发生发展本研究进一步证实可靶向结合
, circ_0003998
的分子机制及相关基因调控可为食管癌的治疗提供新并可负向调控的表达研究表明
miR-1184,miR-1184。
方向可充当的海绵分子而发挥作在膀胱癌中表达下调上调其表达可抑制膀
,circRNAmiRNAmiR-1184,
用胱癌细胞增殖迁移和侵袭[15]在结直肠
,circRNA-0008717、circRAD23B、circ_0003340、circ_、。miR-1184
在食管癌细胞中表达上调并癌中表达量降低上调其表达可抑制结直肠癌发展进
0006168、circ_0006948,,
可通过调节表达而促进细胞增殖及程[16]干扰表达可抑制膀胱癌细胞增
miRNA/mRNA。circBC048201
侵袭[7-11]殖迁移和侵袭[17]本研究结果显示食管癌组织中
。、。,
在非小细胞肺癌组织和细胞中高表的表达量低于癌旁组织上调其表达可抑制
miR-1184,
circ_0003998食管癌细胞增殖克隆形成迁移及侵袭而抑制其表
达敲低其表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵、、,
,达可回复干扰表达对食管癌细胞增殖
袭[12]在肝癌组织和细胞中表达上调circ_0003998、
。circ_0003998,克隆形成迁移及侵袭的抑制作用提示
并可用于诊断肝癌的潜在生物学标记物[13]但、。circ_
。circ_可通过靶向而促进食管癌细胞增
在食管癌中的表达尚未可知本研究结果显0003998miR-1184
0003998。殖克隆形成迁移及侵袭
示食管癌组织中的表达量高于癌旁组、、。
,circ_0003998综上所述食管癌组织中的表达量
织干扰其表达可降低食管癌细胞活力及克隆形成能 ,circ_0003998
,升高的表达量降低干扰表
力提示干扰表达可抑制食管癌细胞增,miR-1184,circ_0003998
,circ_0003998达可通过上调的表达而抑制食管癌细胞增
殖及克隆形成miR-1184
。殖克隆形成迁移及侵袭与
上皮间质转化是指在某些条件下具有极、、,circ_0003998miR-1184
-(EMT)可能作为食管癌治疗的潜在靶点下一步将开展体内
性的上皮细胞失去极性转化成间充质细胞从而促使迁,
实验进一步验证对食管癌发
移及侵袭发生是上皮细胞标志物circ_0003998/miR-1184
,E-cadherin,N-生发展的作用
是间充质细胞标志物当二者表达失调可调。
cadherin,参考文献
控转化过程从而参与细胞转移过程[14]本研究
EMT。
结果显示干扰表达后食管癌细胞划痕1 FanL,CaoQ,LiuJ,
,,
愈合率降低侵袭细胞数减少蛋白水平降2019,18:16-26.
,,N-cadherin2 ZhangZ,LinW,GaoL,
低蛋白水平升高提示干扰(下转页)
,E-cadherin,circ_00039981633
河北医药年月第卷第期
202264411 HebeiMedicalJournal,2022,
常的高表达还与患者的不良预后显著相关本研究检
。6 XieZC,LiTT,GanBL,-136-5pkeytarget
测了肾癌组织和肾癌细胞中的表达发现genesandpathwaysinlungsquamouscellcancerbasedonTCGA
P4HB,,2018,214:
的表达水平均明显上调这与等[14,15]的实验结果
,Xie644-654.
相吻合此外本研究还通过构建过表达的肾7 GengY,BaoY,ZhangW,
。,P4HB
癌细胞检测其增殖迁移侵袭情况发现过表达apoptosisinnon-smallcelllungcancerbyspongingmiR-136-5pand
、、,,2020,18:748-756.
明显抑制肾癌细胞的增殖迁移和侵袭这为探
P4HB、,8 XieZC,LiTT,GanBL,-136-5pkeytarget
究在肾癌中发挥致癌作用的具体机制奠定了基genesandpathwaysinlungsquamouscellcancerbasedonTCGA
,2018,214:
础有助于用于肾癌的早期诊断预后深入探
,P4HB、。644-654.
究发现过表达还逆转对肾癌细胞9 ChenP,ZhaoL,PanX,-136-5p
,P4HBmiR-136-5p
,2018,
。25:5995-6002.
综上所述抑制肾癌细胞的