Circ 0032821参与索拉非尼抑制乳腺癌细胞系T47D增殖、迁移和侵袭.pdf

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20229September2022
第卷第期

文章编号:()研究论文
1001-6325202209-1350-06
参与索拉非尼
Circ_0032821
抑制乳腺癌细胞系增殖迁移和侵袭
T47D、
张晓雷1∗,刘静2,李朝萍3
黄河三门峡医院乳腺外科健康体检科河南三门峡
(1.;2.,472000;
郑州大学附属洛阳中心医院肿瘤中心河南洛阳
3.,471000)
摘要:目的探讨索拉非尼对乳腺癌细胞系增殖迁移侵袭的影响和可能的作用机制方法通过
T47D、、。CCK-8
法平板集落实验划痕愈合实验和小室法检测索拉非尼和对细胞增殖集
、、Transwell(、510μmol/L)T47D、
落形成迁移和侵袭的影响检测表达将小干扰
、。RT-qPCRcirc_0032821。circ_0032821RNA(si-circ_0032821)、
过表达质粒分别转染细胞检测干扰或过表达联合索拉非尼对
circ_0032821T47D,circ_0032821circ_0032821
细胞恶性行为的影响结果索拉非尼处理后细胞增殖抑制率显著升高P集落形成数划
T47D。,T47D(<),、
痕愈合率侵袭数以及表达显著降低P沉默后细胞增殖抑制率显著
、circ_0032821(<)。circ_0032821,T47D
升高P集落形成数划痕愈合率侵袭数显著降低P过表达明显减弱索拉非尼
(<),、、(<)。circ_0032821
对细胞增殖迁移集落形成和侵袭的影响结论索拉非尼可抑制细胞增殖迁移和侵袭其机制
T47D、、。T47D、,
可能与下调表达有关
circ_0032821。
关键词:索拉非尼乳腺癌增殖迁移
;;;;circ_0032821
中图分类号:文献标志码:

DOI:
.1001-
Circ_0032821isinvolvedinsorafenib'sinhibitionof
theproliferation,migrationandinvasionofbreastcancercelllineT47D
1∗23
ZHANGXiao-lei,LIUJing,LIChao-ping
(;,SanmenxiaHospitalofYellowRiver,Sanmenxia472000;
,LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang471000,China)
AbstractObjective
:Toinvestigatetheeffectandpossiblemechanismofsorafenibontheproliferation,migration
Methods
(,5and10μmol/L)onT47Dcells
proliferation,colonyformation,migrationandinvasionweredetectedbyCCK-8experiment,platecloning
experiment,-qPCRwasappliedtodetectcirc_0032821ex-
(si-circ_0032821)andcirc_0032821over-expressionplasmidwere
-ex-
Results
-
P
tioninhibitionrateT47Dcellsweresignificantlyincreasedaftersorafenibtreatment(<);Thecolonyformation
收稿日期:修回日期:
2021-06-112021-12-13
基金项目:河南省科技发展计划
(1603002A-1)
∗通信作者(correspondingauthor):
******@
张晓雷参与索拉非尼抑制乳腺癌细胞系增殖迁移和侵袭
Circ_0032821T47D、1351
P
number,scratchhealingrate,invasionnumber,andcirc_0032821expressionweresignificantlydecreased(<).Af-
tersilencingwiththeexpressionofcirc_0032821,theproliferationinhibitionrateofT47Dcellswassignificantly
P
increased(<);Thecolonyformationnumber,scratchhealingrateandinvasionnumberweresignificantlyreduced
P
(<).Circ_0032821over-expressionsignificantlyreducedtheeffectsofsorafenibontheproliferation,migrationcol-
PConclusions
onyformationandinvasionofT47Dcells(<).SorafenibcaninhibitT47Dcellproliferation,migra-
-regulationofcirc_0032821.
Keywords
:sorafenib;breastcancer;proliferation;migration;circ_0032821
索拉菲尼是一种广谱口服多激酶试剂盒和细胞计数试剂盒
(sorafenib)Mix(CellCountingKit,
小分子抑制剂已被美国食品和药物管理局批准南京诺唯赞生物公司提取上海碧
,CCK-8,);TRIzol(
用于治疗晚期肾细胞癌转移性肝癌[1]研究显云天生物公司和反转
、。);Lipofectamine2000M-MLV
示在乳腺癌异种移植瘤和转移模型中索拉菲尼录酶公司
,,(Invitrogen)。
可抑制血管生成转移提高环磷酰***
、,
性[2]然而索拉非尼在乳腺癌中的抗癌作用和细胞的培养和分组将细胞用含
。,:T47D10%
分子机制并未阐明环状胎牛血清的杜尔伯格伊戈尔培养基
。RNA(circularRNA,(Dulbecco's
是一类在组织和细胞中广泛存在的非编于含
circRNA)modifiedEaglemedium,DMEM),5%CO2、
码通过与微小结饱和湿度培养箱中培养胰蛋白酶消化已达
RNA,RNA(microRNA,miRNA)37℃、。
合间接调节靶表达参与多种细胞过程目汇合的细胞为单个细胞按照比传代培
mRNA。80%;1∶3
前已证实表达改变与乳腺癌进展的多个养在孔板中接种5个对数期细胞
,circRNA。62×10T47D。
过程相关[3-4]研究报道在胃癌中按照使用说明将
。circ_0032821Lipofectamine2000si-NC、si-circ_
表达上调可能是胃癌淋巴结转移和预后不良的或分别转染汇合
,0032821pcDNA-circ_003282150%
生物标志物敲除可导致细胞增的细胞在转染时用检测
。circ_0032821T47D。48h,RT-qPCR
殖上皮间质转化和迁移受到抑制[5]然而细胞中相对水平以验证转染效
、。,circ_T47Dcirc_0032821
在乳腺癌中的表达和功能尚不清楚因果实验分组用分别含或索拉
0032821。。:、510μmol/L
此本研究拟通过分析索拉菲尼对乳腺癌细胞系非尼[6]的培养液孵育细胞转染和
,T47D;si-NC
增殖迁移和侵袭以及表达的的细胞分别记为组和
T47D、circ_0032821si-circ_0032821T47Dsi-NC
影响旨在揭示索拉菲尼在乳腺癌中抗癌作用和组用含索拉非尼的培
,si-circ_0032821;10μmol/L
潜在机制养液孵育转染的细胞
。pcDNA-circ_0032821T47D,
记为索拉非尼组
1材料与方法+pcDNA-circ_0032821。
法检测细胞增殖在孔板中接种
-8:96

4×10T47D。
细胞人乳腺癌细胞系中国科学院上索拉非尼浓度的培养液孵育更换为含
:T47D(48h,10%
海细胞库的培养液再孵育酶标仪测定处
)。CCK-8,2h,450nm
试剂和试剂盒索拉非尼纯度先的吸光度A增殖抑制率实验孔A对
:(≥%,()。(%)=(1-/
用二***亚砜配置成母液后用细胞培养液液稀释照孔A
,)×100%
至实验浓度海南满方园医药公司平板集落实验检测细胞增殖能力在孔板
;);:6
小干扰中接种个各组细胞轻轻晃动平板使细
RNA(circ_0032821smallinterferingRNA,200T47D,
及其阴性对照胞均匀分散放入培养箱孵育当细胞成为
si-circ_0032821)(smallinterfering,12~15d,
过表达质集落时终止培养弃去细胞悬液分别用多聚
RNAnegativecontrol,si-NC)、circ_0032821。,4%
粒甲醛固定结晶紫染色在显微镜下计数各组
(circ_0032821over-expressedplasmid,pcDNA-circ_、%。
上海生工生物公司细胞大于个细胞集落数
0032821)();SYBRGreenMasterT47D(50)。
基础医学与临床
(9)
划痕愈合率实验检测细胞迁移将各组内参磷酸甘油醛脱氢酶
:GAGCTGCAATCTGG-3'。
细胞接种于孔板每孔4个细胞用GAPDH上
T47D6,1×10,(glyceraldehydephosphatedehydrogenase,)
枪头垂直于孔板底部划伤单层细胞替换游引物下游
1mL6。:5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3';
为无血清培养基将孔板放入培养箱培养在培引物
,6。:5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

024h,ImagJ。
痕愈合率划痕宽度划痕宽度划用进行统计分析实验独立重复
=(0h-24h)/,3
痕宽度次计量资料以均值标准差xs表示两组比较
×100%,±(±)。
小室法检测细胞侵袭每组取采用独立样本t检验多组比较采用单因素方差分
:3×,
3个细胞重新悬浮于无血清培养基析和t检验
10T47D200μLLSD-。
中并接种上室包被基质胶涂层将
Transwell(),2结果
补充胎牛血清的培养基加入下
600μL20%DMEM

。24h,Transwell
附着细胞和基质胶多聚甲醛固定室与对照组比较索拉非尼和
,4%Transwell,(、510μmol/L)
膜下表面细胞结晶紫染色在倒置显微镜下组细胞增殖抑制率显著升高集落形成数划
,%。T47D,、
计数个随机视野细胞总数取均值表示细痕愈合率及侵袭数量均显著降低P且索拉
5,T47D(<),
胞侵袭数量非尼对细胞生物行为的抑制作用呈浓度依赖
。T47D
检测表达用性表图
-qPCRcirc_0032821:TRIzol(1,1)。

T47DRNA。
光光度法计算为检测表达用的影响
。circ_0032821,M-MLV
酶进行反转录用试剂盒进与对照组比较索拉非尼
,SYBRGreenMasterMix,(、5、10μmol/L)
行采用-ΔΔCt法分析相对表组细胞相对水平显著降低
RT-qPCR。2circ_0032821T47Dcirc_0032821
达量上游引物P且索拉非尼对表达的抑
。Circ_0032821:5'-AGGAATCT(<)。circ_0032821
下游引物制作用呈浓度依赖性表
GAGTTGCAGTGTCTC-3',:5'-TGATCCTT(2)。
表1索拉非尼抑制T47D细胞增殖、迁移和侵袭
Table1Sorafenibinhibitedtheproliferation,migrationandinvasionofT47Dcells(x±s,n=3)
group/(μmol/L)inhibitionrate/%numberofcoloniesformedscratchhealingrate/%numberofinvasioncells
control()±±±±4
∗∗∗∗
sorafenib()±±±±3
∗#∗#∗#∗#
sorafenib()±±±±2
∗#△∗#△∗#△∗#△
sorafenib(10)±±±±2
∗P#P△P
<;<;<.
、迁移和
Table2Effectofsorafeniboncirc_0032821expression侵袭的影响
inT47Dcells(x±s,n=3)
组细胞中
Si-circ_0032821T47Dcirc_0032821
group/(μmol/L)circ_0032821相对水平显著低于组表明转染
si-NC,si-circ_
control()±
∗
sorafenib()±。si-NC
∗#组比较组细胞增殖抑制率显
sorafenib()±,si-circ_0032821T47D
∗#△著升高P集落形成数划痕愈合率侵袭数
sorafenib(10)±(<),、、
∗P#P量显著降低P图表
<;<(<)(2,3)。
△P
;<.
张晓雷参与索拉非尼抑制乳腺癌细胞系增殖迁移和侵袭
Circ_0032821T47D、1353
;(×40);-
afenibonthenumberofT47Dinvasioncells(scalebar=200μm)
图1索拉非尼对T47D细胞增殖、迁移和侵袭的影响
Fig1Effectofsorafenibontheproliferation,migrationandinvasionofT47Dcells
;-
vasioncells(scalebar=200μm);(×40)
图2沉默circ_0032821对T47D细胞恶性行为的影响
Fig2Effectofsilencingcirc_0032821onthemalignantbehaviorofT47Dcells
基础医学与临床
(9)

3讨论
T47D细胞增殖、迁移和侵袭的影响
与对照组比较索拉非尼组细胞增殖索拉菲尼通过抑制肿瘤生长转移和血管生成
,T47D、,
抑制率显著升高P集落形成数划痕愈诱导细胞凋亡在多种人类癌中表现出抗癌潜力
(<);、,。
合率侵袭数量以及相对水平显著索拉菲尼可抑制细胞内酪氨酸激酶
、circ_0032821(JanusKinase,
降低P与索拉非尼组比较索拉非尼信号传导及转录活化因子
(<);,+JAK)/(signaltransducers
组细胞增殖抑制率显信号通路进而
pcDNA-circ_0032821T47Dandactivatorsoftranscription,STAT),
著降低P集落形成数划痕愈合率侵诱导肝癌细胞凋亡抑制细胞增殖[7]业已发
(<),、、,。
袭数量以及相对水平显著升高现[8-9]索拉菲尼在肝癌中的促凋亡抗血管生成作
circ_0032821,、
P图表用与抑制促分裂原活化的蛋白激酶
(<)(3,4)。(mitogen-activated
表3沉默circ_0032821抑制T47D细胞增殖、迁移和侵袭
Table3Silencingcirc_0032821inhibitedtheproliferation,migrationandinvasionofT47Dcells(x±s,n=3)
groupcirc_0032821inhibitionrate/%numberofcoloniesformedscratchhealingrate/%numberofinvasioncells
si-±±±±±6
∗∗∗∗∗
si-±±±±±1
∗P
<-NCgroup.
-expressionofcirc_0032821canreversetheeffectofsorafenibonT47Dcolonyformation;-expressionof
circ_0032821couldreversetheeffectofsorafenibonT47Dscratchhealing(×40);-expressionofcirc_0032821
couldreversetheeffectofsorafenibonT47Dinvasion(scalebar=200μm)
图3过表达circ_0032821可逆转索拉非尼对T47D细胞恶性行为的作用
Fig3Over-expressionofcirc_0032821couldreversetheeffectofsorafenibonthemalignantbehaviorofT47Dcells
表4过表达circ_0032821可逆转索拉非尼对T47D细胞恶性行为的抑制作用
Table4Over-expressionofcirc_0032821couldreversetheinhibitoryeffectofsorafenibonthemalignant
behaviorofT47Dcells(x±s,n=3)
inhibitionnumberofcoloniesscratchhealingnumberof
groupcirc_0032821
rate/%formedrate/%invasioncells
±±±±±4
∗∗∗∗∗
±±±±±2
#####
sorafenib+pcDNA-±±±±±3
∗P#P
<;<.
张晓雷参与索拉非尼抑制乳腺癌细胞系增殖迁移和侵袭
Circ_0032821T47D、1355
胞外信号调节激酶外通过靶向下调促进
proteinkinase,MEK)/(extracel-,circ_0032821miR-515-5p
通路活化有关也有研胃癌细胞奥沙利铂耐药[14]本研究发现索拉菲
lularregulatedkinase,ERK)。。,
究证实[10]索拉菲尼以剂量依赖方式诱导胃癌细胞尼处理后细胞中表达水平显
,T47Dcirc_0032821
凋亡抑制细胞增殖此外有报道[11]索拉非尼和著下调但低表达是否介导索拉菲
,。,,。circ_0032821
多柔比星联用对肺癌细胞乳腺癌细胞具有促凋亡尼的抗肿瘤作用并不清楚本研究结果显示干
、。,
作用本研究探讨索拉菲尼对乳腺癌细胞生物行为扰表达明显抑制细胞活力降
。circ_0032821T47D,
的影响结果表明索拉菲尼处理显著抑制乳腺癌细低其集落形成迁移和侵袭能力这与索拉菲尼的
,,、,
胞活力降低其集落形成迁移和侵袭能力抗肿瘤效果类似进一步的逆转实验表明过表
T47D,、,。,
这与已有报道[12]结论吻合转移是乳腺癌治疗失达可减弱索拉菲尼对细胞生物
。circ_0032821T47D
败的重要原因因此索拉非尼通过抑制肿瘤细胞增行为的抑制作用提示下调可能是索
,,circ_0032821
殖侵袭转移具有提高乳腺癌患者生存率潜力拉菲尼在乳腺癌中发挥抗肿瘤作用的重要途径
、。。
表达异常已被证实与胃癌进展相总之索拉菲尼可有效抑制乳腺癌细胞增
Circ_0032821,T47D
关胃癌组织和细胞系中表达上调殖迁移和侵袭其抗肿瘤机制可能是通过下调
。circ_0032821。、,circ_
沉默则可抑制胃癌细胞的体外增殖实现的提示索拉菲尼是对抗乳腺癌转移的
circ_0032821、0032821,
转移能力抑制糖酵解代谢抑制胃癌发生[13]此重要药物并为乳腺癌治疗提供潜在有效靶点
,,。,。
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