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二十世纪70年代以来,随着免疫学技术的发展,酶的定量分析技术中出现了许多利
用酶蛋白的抗原性,通过抗原抗体反应直接测定酶的免疫化学测定法。与经典的测定酶
活性方法比较,这些方法不仅灵敏度高,而且能测定一些以前不易测定或测定条件不易
掌握的酶。
(一)测定原理
放射免疫测定(RIA)分为直接法与间接法。
直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀,然后将沉淀分离并进行定量测定。
间接法是将样品中无放射性的酶蛋白与放射性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争,根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。以间接法为最常用。
另外还有免疫抑制法、化学发光免疫测定(CLIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定(FEIA)等。
报告方式有两类:
一类是用酶活性浓度单位,如免疫抑制法测定CK-MB酶活性(actiyity),结果常以U/L报告;
另一类是用质量浓度单位,如用免疫学方法测定CK-MB酶质量(mass)(即蛋白量),结果常直接用ng/ml或6μg/L报告。
(二)免疫化学测定的优缺点
血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化
两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条件等影响而失活,一些激活剂或抑制剂对酶
活性也有影响,因而酶活性常不能正确反映酶的情况,出现酶活性与酶蛋白绝对量不一
致,有时甚至出现两者变化完全相反的情况。
与传统的酶活性测定法相比,免疫化学测定法的优点主要有:
①灵敏度高,能测定其他方法不易测出的少量或痕量酶;
②特异性高,不受体液中其他物质,如酶抑制剂、激活剂等的影响;
③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白,如各种酶原或去辅基酶蛋白,或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定;④特别适用于同工酶的测定。
酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有:
①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的,而且工作量很大;
②测定步骤多,操作繁琐;
③测定成本高。
第六节同工酶及其亚型测定
特别是纸片法简便快速,适用于急诊有机磷中毒的快速筛查。
临床上****惯用U/L来表示体液中酶催化浓度。
γ-GT4与胆红素增高密切相关。
与传统的酶活性测定法相比,免疫化学测定法的优点主要有:
ALT有两种不同活性的同工酶α(ALTs)、β(ALTm),分别存在于细胞质及线粒体,后者的活性为前者的16倍。
一般CK-MB2>1.
酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。
血清中的γ-GT则主要来自肝胆,红细胞中几乎无γ-GT,因此溶血对其测定影响不大。
LD同工酶都出现LDl/LD2>1,即所谓“反转比率”现象,且持续的时间长。
但神经疾病引起的肌萎缩,CK活性一般正常。
草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+
用电泳法进行同工酶分析时,如显示的区带数与同工酶数不一致时,要特别注意巨分子酶的存在。
L-丙氨酸+α-***戊二酸 L-谷氨酸+L-***酸
另一大类以乳酸为底物的顺向反应(称LD-L法)。
迄今测定LPS的方法可分为3类:测定产物(游离脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等);
可在340nm波长下测定NADPH生成速率而计算CK活性浓度。
电泳法的使用最为广泛。
亚型指基因在编码过程中,由于翻译修饰差异所形成的多种形式的一类酶。
我国多采用目前IFCC参考方法LD-L法,用连续监测法进行测定。
与传统的酶活性测定法相比,免疫化学测定法的优点主要有:
一、概念
同工酶是同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体,具有相同的催化功能,但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。
亚型某些酶或同工酶从组织进入体液后,可进一步变化为数个不同类型即所谓“亚型,也称为同工型(isoform)”。即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。
三、分析方法
临床同工酶的分析大致可分为两步,即首先精确地分离出某酶的各同工酶组分,然后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性。