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临床与病理杂志
2022,42(5)
1028JClinPatholRes
doi:.2095-
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MiR-199a对缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层神经元
细胞活力及凋亡的影响
巩雨,樊嘉欣,高震,王虎清,吴海琴
(西安交通大学第二附属医院神经内科,西安710004)
[摘 要]目的:探讨miR-199a对缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层神经元细胞活力及凋亡的影响。方法:在体外
培养大鼠脑皮层神经元细胞,采用缺氧/复氧的方式处理细胞建立细胞损伤模型并记作Model组;
将正常培养的细胞作为对照(Con)组。分别将空载体、miR-199amimic转染至大鼠脑皮层神经元
细胞,建立缺氧/复氧细胞损伤模型,分别记作Model+NC组或Model+miR-199amimic组。将miR-
199amimic转染至大鼠脑皮层神经元细胞后加入PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002处理,随后
建立缺氧/复氧细胞损伤模型,记作Model+miR-199amimic+LY294002组。采用反转录PCR法检测
miR-199a的表达量,应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,采用MTT法检测细胞活力,采
用蛋白质印迹法检测cleaved-caspase3、pro-caspase3、p-PI3K、p-AKT蛋白表达量。结果:与Con
组比较,Model组miR-199a的表达水平、细胞活力、S期细胞比例及pro-caspase3、p-PI3K、p-AKT
蛋白表达水平均显著降低,G0~G1期细胞比例、细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达水平均显著
提高,差异均有统计学意义(均P<)。与Model+NC组比较,Model+miR-199amimic组细胞活
力、S期细胞比例及pro-caspase3、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平均显著提高,G0~G1期细胞比例、
细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达水平均显著降低,差异均有统计学意义(均P<)。与
Model+miR-199amimic组比较,Model+miR-199amimic+LY294002组细胞活力、S期细胞比例及pro-
caspase3蛋白表达水平均显著降低,G0~G1期细胞比例、细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达水
平均显著提高,差异均有统计学意义(P<)。结论:MiR-199a过表达可改善缺氧/复氧诱导的大
鼠脑皮层神经元细胞活力并抑制细胞凋亡,从而减轻细胞损伤;这些生物学效应可能是通过激活
PI3K-AKT信号通路产生的。
[关键词]miR-199a;缺氧/复氧;脑皮层神经元细胞;活力;凋亡;AKT;大鼠
EffectsofmiR-199aontheviabilityandapoptosisofratcerebral
corticalneuronscellsinducedbyhypoxia/reoxygenation
GONGYu,FANJiaxin,GAOZhen,WANGHuqing,WUHaiqin
(DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)
AbstractObjective:ToexploretheeffectofmiR-199aontheviabilityandapoptosisofratcerebralcorticalneuronscells
收稿日期(Dateofreception):2021–11–15
通信作者(Correspondingauthor):吴海琴,Email:******@
基金项目(Foundationitem):陕西省重点研发计划(2017SF-181)。ThisworkwassupportedbytheKeyR&DPlanofShaanxiProvince,China(2017SF-181).
MiR-199a对缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层神经元细胞活力及凋亡的影响巩雨,等1029
inducedbyhypoxia/:Ratcerebralcorticalneuronscellswereculturedinvitroand
treatedwithhypoxia/reoxygenationtoestablishthecellinjurymodelandrecordedasModelgroup,andnormal
culturedcellswereusedascontrol(Con)-199amimicwererespectivelytransfected
intoratcerebralcorticalneuronscells,andthenhypoxia/reoxygenationcellinjurymodelswereestablished,which
wererecordedasModel+NCgrouporModel+miR-199amimicgroup,-199amimicwas
transfectedintoratcerebralcorticalneuronscells,PI3K-AKTsignalingpathwayinhibitorLY294002wasadded
fortreatment,andthenhypoxia/reoxygenationcellinjurymodelwasestablishedandrecordedasModel+miR-
199amimic+,theexpressionofmiR-199awasdetectedbyRT-PCR,thecellcycleand
apoptosisrateweredetectedbyflowcytometry,thecellviabilitywasdetectedbyMTT,andtheexpressionof
Cleaved-caspase3,pro-caspase3,p-PI3Kandp-:Compared
withCongroup,theexpressionlevelofmiR-199a,cellviability,S-phasecellproportionandtheexpressionlevels
ofpro-caspase3,p-PI3Kandp-AKTproteininModelgroupweresignifcantlylower,whilethecellproportion
ofG0–G1phase,theapoptosisrateandtheexpressionlevelofcleaved-caspase3proteinweresignifcantlyhigher
inModelgroup(P<).ComparedwiththeModel+NCgroup,thecellviability,theproportionofS-phase
cellsandtheexpressionlevelsofpro-caspase3,p-PI3Kandp-AKTproteinintheModel+miR-199amimicgroup
weresignifcantlyincreased,whiletheproportionofG0–G1phasecells,therateofapoptosisandtheexpression
levelofcleaved-caspase3proteinweresignifcantlydecreased(P<).ComparedwiththeModel+miR-199a
mimicgroup,thecellviability,theproportionofS-phasecellsandtheexpressionlevelofpro-caspase3proteinin
theModel+miR-199amimic+LY294002groupweresignifcantlydecreased,andtheproportionofG0–G1phase
cells,theapoptosisrateandtheexpressionlevelofcleaved-caspase3proteinweresignifcantlyincreased(P<).
Conclusion:TeoverexpressionofmiR-199acouldimprovetheviabilityofratcerebralcorticalneuronscells
inducedbyhypoxia/reoxygenationandinhibitcellapoptosis,
efectsmaybeachievedbyactivatingPI3K-Aktsignalingpathway.
KeywordsmiR-199a;hypoxia/reoxygenation;cerebralcorticalneuronscells;viability;apoptosis;AKT;rat
脑卒中是临床常见疾病,是导致死亡加伤残AKT信号通路的调控作用。
的全球第三大原因,其中缺血性脑卒中占脑卒中
%[1]。缺血缺氧是造成脑组织损伤的重要原1材料与方法
因之一,但关于其具体作用机制尚未阐明,因而
重要意义[2-3]。微小RNA(microRNA,miRNA)可能大鼠脑皮层神经元细胞购自上海名劲生物科
参与脑卒中等脑血管疾病发生及发展过程[4-5]。由技有限公司;PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002
于微小RNA-199a(microRNA-199a,miR-199a)在购自美国Selleck公司;DMEM培养基购自上海沪
窒息新生儿血清中的表达水平降低,可能在缺氧震生物科技有限公司;胎牛血清购自上海中乔新
性脑损伤中发挥调控作用[6];磷脂酰肌醇-3-激酶舟生物科技有限公司;LipofectamineTM2000购自
(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶上海素尔生物科技有限公司;TRIzol、反转录与
B(proteinkinaseB,PKB/AKT)信号通路与细胞活real-timePCR试剂购自北京天根生化科技有限公
力及凋亡等生物学过程密切相关,其激活可抑制司;MTT试剂购自上海华雅思创生物科技有限公
神经细胞凋亡从而保护脑组织[7],但miR-199a是否司;凋亡检测试剂盒购自北京博迈斯科技发展有
可调控缺血性脑卒中的发展以及PI3K-AKT信号通限公司;miR-199amimic、空载体(NC)购自广州
路是否参与介导该过程尚未可知。因此,本研究锐博生物技术有限公司;兔抗鼠cleaved-caspase3、
采用缺氧/复氧建立大鼠脑皮层神经元细胞损伤模pro-caspase3抗体购自美国SantaCruz公司;兔抗鼠
型,探讨miR-199a对缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层p-PI3K、p-AKT抗体购自北京普利莱基因技术有限
神经元细胞活力及凋亡的影响,并探究其对PI3K-公司;HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉
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金桥生物技术有限公司。中加入RNaseA(50μL),水浴30min(37℃)。加入PI
染色液450μL,4℃孵育30min,应用BDAccuriTM
。
,实验重复3次。
细胞,待细胞生长融合度达到70%时进行转染,接取各组大鼠脑皮层神经元细胞(×105个/mL)接
种于6孔板(3×105个/孔)。采用不含胎牛血清的培种于96孔板(100μL/孔),加入MTT溶液(20μL/孔)后
养基(250μL)分别稀释NC、miR-199amimic并室温继续培养4h,弃上清。分别加入DMSO(150μL/孔),
孵育5min,采用不含胎牛血清的培养基(250μL)于室温振荡孵育5min,应用酶标仪检测各孔光密
稀释脂质体LipofectamineTM2000(10μL)并室温孵育度值(OD值)。每组3个复孔,实验重复3次。
5min。将含NC或miR-
与脂质体稀释液充分混匀后室温孵育20min,将其取各组大鼠脑皮层神经元细胞加入预冷PBS
加入6孔板的细胞中(400μL/孔),转染6h后弃培洗涤,弃上清。加入500μL结合缓冲液重悬细
养液,更换正常培养液培养48h后构建缺氧/复氧胞,参照试剂盒说明书操作,应用BDFACSDIVA
模型,并分别记作Model+NC组、Model+miR-199a软件检测各组细胞凋亡率。每组3个复孔,实验重
mimic组。按上述方法转染miR-199amimic的24h复3次。
后,.7蛋白质印迹法检测cleaved-caspase3、pro-caspase3、
24h[8],随后构建缺氧/复氧模型,并记作Model+p-PI3K、p-AKT蛋白质表达
miR-199amimic+LY294002组。将同期未转染的细提取大鼠脑皮层神经元细胞总蛋白质,取
胞构建缺氧/复氧模型并记作Model组,正常培养适量蛋白样品进行SDS-PAGE反应,转移至PVDF
的细胞作为对照(Con)组。膜,室温封闭2h。分别孵育一抗稀释液(1:1000)
(1:2000),于室温孵育1h,曝光显
大鼠脑皮层神经元细胞接种于96孔板(5×影后应用ImageJ软件分析各条带灰度值。每组3个
103个/孔),待细胞生长融合度达到80%时将培养复孔,实验重复3次。
液更换为缺氧液,置于缺氧密闭容器(95%N2、
5%CO2)内缺氧处理3h,更换复氧培养液,
氧容器(95%O2、5%CO2)内复氧处理2h,,计量
[9]
氧/复氧模型。造模后在37℃、体积分数5%CO2资料以均数±标准差(x±s)表示,且均符合正态分
培养箱内培养用于后续实验。布,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较
-199a的表达水平采用单因素方差分析(两两比较采用LSD-t检验),
采用TRIzol法提取各组大鼠脑皮层神经元P<。
细胞总RNA,将总RNA反转录合成cDNA(严格
按照试剂盒说明书进行操作),以cDNA为模板2结果
进行real-timePCR反应,按照荧光定量PCR试剂
盒说明书检测miR-199a相对表达量。miR--199a对缺氧/复氧大鼠脑皮层神经元
正向引物5'-GCGCCCAGTGTTCAGA-3',反向细胞周期及细胞活力的影响
引物5'-GTCGTATCCAGTCAG-3';U6正向引物与Con组比较,Model组、Model+NC组miR-
5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向引199a的表达水平降低、G0~G1期细胞比例升高、
物5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。每组3个复S期细胞比例降低、OD值降低,差异均有统计学
孔,实验重复3次。意义(均P<);但G2~M期细胞比例比较差异
(P>)。与Model组、Model+NC
各组大鼠脑皮层神经元细胞(1×106个/mL)接种组比较,Model+miR-199amimic组miR-199a的表
于96孔板(100μL/孔),加入预冷PBS,以3000r/min达水平升高、G0~G1期细胞比例降低、S期细胞
离心5min,弃上清。加入预冷PBS重悬细胞(500μL),比例升高、OD值升高,差异均有统计学意义(均
加入预冷70%乙醇(),充分混匀,4℃孵育P<);但G2~M期细胞比例比较差异无统计学
24h,3000r/min离心5min,弃上清。向细胞沉淀意义(P>,表1)。
MiR-199a对缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层神经元细胞活力及凋亡的影响巩雨,等1031
表1MiR-199a对缺氧/复氧模型细胞周期及细胞活力的影响
Table1EfectsofmiR-199aoncellcycleandcellviabilityinhypoxia/reoxygenationmodel
组别miR-199aG0~G1/%S/%G2~M/%OD值
±±±±±
±*±*±*±±*
Model+±*±*±*±±*
Model+miR-±*#&±*#&±*#&±±*#&
P<<<<
与Con组相比,*P<;与Model组相比,#P<;与Model+NC组相比,&P<。
ComparedwithCongroup,*P<;ComparedwithModelgroup,#P<;ComparedwithModel+NCgroup,&P<.
-199a对缺氧/-199a对缺氧/复氧大鼠脑皮层神经元
细胞凋亡的影响细胞中PI3K-AKT信号通路的影响
与Con组比较,Model组、Model+NC组凋与Con组比较,Model组、Model+NC组
亡率升高、Cleaved-caspase3蛋白水平升高、pro-p-PI3K、p-AKT蛋白水平显著降低,差异均有统计
caspase3蛋白水平降低,差异均有统计学意义学意义(均P<)。与Model组、Model+NC组比
(均P<)。与Model组、Model+NC组比较,较,Model+miR-199amimic组p-PI3K、p-AKT蛋白
Model+miR-199amimic组凋亡率降低、cleaved-水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<;
caspase3蛋白水平降低、pro-caspase3蛋白水平升图2,表3)。
高,差异均有统计学意义(均P<;图1,表2)。
ConModel
A104104B
103103
102102
PIPI
101101
100100
0123401234
10101010101010101010ConModelModel+NCModel+miR-199amimic
AnnexinV-FITCAnnexinV-FITC
Cleaved-caspase3
Model+NCModel+miR-199amimic
4
10104
3pro-caspase3
10103
102102
PI
PIGAPDH
101101
100100
100101102103104100101102103104
AnnexinV-FITCAnnexinV-FITC
图1MiR-199a对缺氧/复氧模型细胞凋亡及caspase3蛋白表达情况的作用
Figure1EfectsofmiR-199aoncellapoptosisandcaspase3proteinexpressioninhypoxia/reoxygenationmodel
(A)流式细胞术检测细胞凋亡;(B)蛋白质印迹法检测蛋白质表达。
(A)Cellapoptosisdetectedbyfowcytometry;(B)ProteinexpressiondetectedbyWesternbloting.
1032临床与病理杂志,2022,42(5)
表2MiR-199a对缺氧/复氧模型细胞凋亡及caspase3蛋白表达的影响
Table2EfectsofmiR-199aoncellapoptosisandcaspase3proteinexpressioninhypoxia/reoxygenationmodel
组别凋亡率/%Cleaved-caspase3Pro-caspase3
±±±
±*±*±*
Model+±*±*±*
Model+miR-±*#&±*#&±*#&
P<<<
与Con组相比,*P<;与Model组相比,#P<;与Model+NC组相比,&P<。
ComparedwithCongroup,*P<;ComparedwithModelgroup,#P<;ComparedwithModel+NCgroup,&P<.
-199a作用的缺氧/复氧
大鼠脑皮层神经元细胞周期及细胞活力的影响
与Model+miR-199amimic组比较,
Model+miR-199amimic+LY294002组G0~G1期细胞
ConModelModel+NCModel+miR-199amimic比例升高(P<)、S期细胞比例降低、OD值降
p-PI3K低,差异均有统计学意义(P<);但G2~M期细
胞比例比较差异无统计学意义(P>,表4)。
p-AKT
-199a作用的缺氧/复氧
GAPDH大鼠脑皮层神经元细胞凋亡的影响
与Model+miR-199amimic组比较,Model+miR-
组凋亡率升高、
图2PI3K-AKT信号通路蛋白表达情况检测199amimic+LY294002cleaved-
Figure2DetectionoftheexpressionofPI3K-AKTsignalingcaspase3蛋白水平升高、pro-caspase3蛋白水平降
pathwayprotein低,差异均有统计学意义(P<,图3,表5)。
表3MiR-199a对缺氧/复氧模型中PI3K-AKT信号通路蛋白质表达的影响
Table3EfectofmiR-199aonPI3K-AKTsignalingpathwayproteinexpressioninhypoxia/reoxygenationmodel
组别p-PI3Kp-AKT
±±
±*±*
Model+±*±*
Model+miR-±*#&±*#&
P<<
与Con组相比,*P<;与Model组相比,#P<;与Model+NC组相比,&P<。
ComparedwithCongroup,*P<;ComparedwithModelgroup,#P<;ComparedwithModel+NCgroup,&P<.
MiR-199a对缺氧/复氧诱导的大鼠脑皮层神经元细胞活力及凋亡的影响巩雨,等1033
表4PI3K抑制剂对miR-199a作用的缺氧/复氧模型细胞周期及细胞活力的影响
Table4EffectsofPI3Kinhibitoroncellcycleandcellviabilityofhypoxia/reoxygenationmodelundertheinterventionof
miR-199a
组别G0~G1/%S/%G2~M/%OD值
Model+miR-±±±±
Model+miR-199amimic+±&±&±±&
t−
P<<<
与Model+miR-199amimic组相比,&P<。
ComparedwithModel+miR-199amimicgroup,&P<.
AB
Model+miR-199amimicModel+miR-199amimic+LY294002
104104
Model+miR-199a
103103Model+miR-199amimicmimic+LY294002
Cleaved-caspase3
102102
PIPI
101101
Pro-caspase3
100100
100101102103104100101102103104
GAPDH
AnnexinV-FITCAnnexinV-FITC
图3PI3K抑制剂对miR-199a作用的缺氧/复氧模型凋亡及caspase3蛋白表达情况的作用
Figure3EffectofPI3Kinhibitoronapoptosisandcaspase3proteinexpressioninhypoxia/reoxygenationmodelunderthe
interventionofmiR-199a
(A)流式细胞术检测细胞凋亡;(B)蛋白质印迹法检测蛋白质表达。
(A)Cellapoptosisdetectedbyfowcytometry;(B)ProteinexpressiondetectedbyWesternbloting.
表5PI3K抑制剂对miR-199a作用的缺氧/复氧模型细胞凋亡及caspase3蛋白表达的影响
Table5EfectsofPI3Kinhibitoroncellapoptosisandcaspase3proteinexpressioninhypoxia/reoxygenationmodelunderthe
interventionofmiR-199a
组别凋亡率/%Cleaved-caspase3Pro-caspase3
Model+miR-±±±
Model+miR-199amimic+±&±&±&
t−−
P<<<
与Model+miR-199amimic组相比,&P<