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低温等离子体促进人牙龈上皮细胞在
钛表面的黏附
张敏敖小刚郑铮陈文川
口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心
四川大学华西口腔医院修复科,成都610041
[摘要]目的研究低温等离子体(NTAP)处理人牙龈上皮细胞(HGECs)后的生物学行为。方法将
HGECs传代培养,待生长活性最佳的第3~5代细胞,消化重悬后经NTAP处理适当时间(0,10,20,30,60s)
后,接种在钛盘表面,加入口腔角质细胞培养基(OKM),1%双抗、5%CO和37℃孵箱条件下培养不同时间
2
(4,12,24,48h)贴壁生长,每组中各培养时间设置5个复孔。使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)评估各组黏
附细胞的数量;扫描电子显微镜(SEM)观察各组细胞在钛片表面的形态;实时荧光定量聚合酶链式反应
(qRT-PCR)检测各组细胞层粘连蛋白α3(Lamininα3)、整合素蛋白β4(Integrinβ4)和网蛋白(Plectin)黏附
相关基因的表达情况以及Westernblot观察各组细胞黏附相关蛋白表达的变化情况。结果在0~20s内,随着
NTAP作用时间的增加,细胞的黏附数量增加;但在20~60s内,随着作用时间的增加,细胞的黏附数量逐渐减
少:证明NTAP处理时间为20s时最有利于HGECs在钛表面的黏附。CCK-8显示:在设定的培养时间下(20s),
随着培养时间延长,对照组和NTAP组细胞在钛表面的黏附数量增加。与对照组相比,在各培养时间点NTAP组
细胞在钛表面的黏附数量更多(P<)。SEM显示:NTAP组细胞在钛表面更明显地表现出不规则的多边形、
突起与伪足较多及更大的细胞扩散面积。qRT-PCR显示:NTAP组细胞在钛表面的Lamininα3、Integrinβ4和
Plectin黏附相关基因表达都高于对照组(P<)。Westernblot也证实:NTAP组细胞在钛表面上Lamininα3、
Integrinβ4和Plectin黏附相关蛋白的表达均高于对照组。结论HGECs受NTAP处理后,结果表明20s的作用
时间能最大程度增加细胞在钛表面的黏附数量和改变黏附形态,同时能够显著上调Lamininα3、
Integrinβ4和Plectin黏附相关基因和蛋白的表达,进而能促进HGECs对钛表面的生物封闭
作用。
[关键词]低温等离子体;人牙龈上皮细胞;黏附;钛表面;生物封闭
开放科学(资源服务)
OSID
[中图分类号][文献标志码]A[doi].()
Promotingtheadhesionofhumangingivalepithelialcellsontitaniumsurfacebynon-thermalatmosphericplas‐
mairradiationZhangMin,AoXiaogang,ZhengZheng,ChenWenchuan.(StateKeyLaboratoryofOralDiseases&
NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&,WestChinaHospitalofStomatology,Si‐
chuanUniversity,Chengdu610041,China)
Supportedby:ResearchandDevelopProgram,WestChinaHospitalofStomatology,SichuanUniversity(LCYJ2019-
13);TechnologyResearchandDevelopmentProjectofChengduScienceandTechnologyBureau(2019-YF05-01328-
SN).Correspondence:ChenWenchuan,E-mail:******@.
[Abstract]ObjectiveThisworkaimedtostudythe
biologicalbehaviorofhumangingivalepithelialcells
[收稿日期]2021-06-04;[修回日期]2022-04-09
[基金项目]四川大学华西口腔医院探索与研发项目(LCYJ2019-(HGECs)irradiatedbynon-thermalatmosphericplasma
13);成都市科学技术局技术创新研发项目(2019-YD05-01328-SN)(NTAP)
[作者简介]张敏,住院医师,硕士,E-mail:******@163.‑⁃
HGECs(35generations)withthebestactivityweredi‐
com
[通信作者]陈文川,教授,博士,E-mail:******@(0,10,20,30,and
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60s)
and1%penicillin/%COat37℃andincubatedfordif‐
2
ferenttimes(4,12,24,and48h;n=5).Cellcountingkit-8(CCK-8)
electronmicroscopy(SEM)-time
polymerasechainreaction(qRT-PCR)andWesternblotwereusedtoevaluatethegeneexpressionofadhesion-related
‑⁃
molecules,suchasLamininα3,Integrinβ4,,
‑⁃
,cellcultureatthetwotimepointsshowedthatHGECsadhesion
,morecellsinthetreatment
groupadheredtothetitaniumsurfaceateachtimepoint(P<).Cellsinthetreatmentgroupshowedmoreirregular
polygons,moreprotrusionsandpseudopods,andalargercelldiffusionareaonthetitaniumsurfacethanthoseinthecon‐
-PCRshowedthattheexpressionlevelsofLamininα3,Integrinβ4,andPlectinadhesion-relatedgeneson
thetitaniumsurfaceinthetreatmentgroupwerehigherthanthoseinthecontrolgroupateachculturetimepoint(P<
).WesternblotshowedthattheexpressionlevelsofLamininα3,Integrinβ4,andPlectinadhesion-relatedproteins
NTAPtreatment,theresultsshowedthat20softreatmenttimecouldmaximizethenumberofadheredcellsonthetitani‐
umsurface;changethecelladhesionmorphology;andsignificantlyupregulatetheexpressionofadhesion-relatedgenes
andproteinsofLamininα3,Integrinβ4,,itcouldpromotethebiologicalsealingeffectof
HGECsonthetitaniumsurface.
[Keywords]non-thermalatmosphericplasma;humangingivalepithelialcells;adhesion;titaniumsurface;bio‐
logicalsealing
种植修复因其突出的优点成为牙列缺损或缺(humangingivalepithelialcells,HGECs)黏附的
失患者主要选择的修复方式。Brånemark等[1]首次同时,也可能增加细菌在基台表面定植的风险,
提出“骨结合”的概念,认为骨结合是种植体修其有效性有待进一步证实[10]。
复成功的关键。然而,种植修复的长期稳定性除考虑到这些局限性,从细胞角度思考,通过
与骨结合相关外,软组织与种植体基台之间的生一种特殊且安全的方法来提高牙龈上皮细胞的黏
物封闭也起到至关重要的作用[2],并对远期成功率附相关活性成为一种可靠方案。近年来,低温等
有重要意义。从解剖上看,种植体周围的软组织离子体(non-thermalatmosphericplasma,NTAP)
封闭主要由两方面组成:上皮组织封闭与纤维组已广泛应用于生物医学工程,包括伤口愈合[11-12]、
织封闭。上皮组织封闭位于纤维组织封闭上方,癌症治疗[13]、创口止血[14]、干细胞分化[15-16]、组织
与口腔环境直接接触,是抵抗外界环境中有害物再生[17-18]、杀菌[19-20]、牙齿美白[21]、根管治疗[22]等
质侵入种植体的第一道屏障。种植体周围上皮方面。Langmuir[23]在1927年首次提出术语“低温
(peri-implantepithelium,PIE)是种植体周围软组等离子体”,定义为一种电离气体,它电离时温度
织生物封闭的关键:与结合上皮(junctionalepi‐接近室温,这是能直接处理活细胞的理论基
thelium,JE)类似,PIE通过半桥粒(hemidesmo‐础[24-25]。Lou等[11]研究发现,He/Ar-NTAP通过激活
−
somes,HDs)和基底板(internalbasaltlamina,I-上皮间充质转化(epithelial-to-mesenchymaltran‐
BL)附着于种植体表面[3-4]。sition,EMT)和细胞周期进程能有效诱导角质形
然而,与JE相比,PIE的封闭能力相对较弱,成细胞的增殖和迁移。同时,基于本课题组之前
形成时间较长,易受到细菌外界刺激的攻击[5]。因的研究[26],发现NTAP可以作为牙周炎治疗的补充
此,近年来学者们也开展了诸多研究,主要针对疗法,有效去除根面及袋内的生物膜。
种植体基台表面的改性,包括基台的涂层[3,6]、选鉴于NTAP这些积极作用,探索NTAP是否对
择性激光烧结[7]、极化处理[8]、直接等离子体喷HGECs在钛表面的黏附也具有促进作用。因此,
涂[9]。虽然在这些方面取得了一些积极的进展,但本研究采用NTAP处理HGECs细胞,然后在扫描
在临床中应用改性的钛基台的技术尚未成熟。其电子显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)
主要原因是改性后的基台增加人牙龈上皮细胞下直接观察细胞黏附情况,并研究HDs和IBL中
第3期张敏,等:低温等离子体促进人牙龈上皮细胞在钛表面的黏附•287•
黏附相关蛋白层粘连蛋白α3(Lamininα3)、整合原有培养基,PBS轻轻洗涤3次。避光条件下,使
素蛋白β4(Integrinβ4)和网蛋白(Plectin)的用细胞计数试剂盒-8(cellcountkit-8,CCK-8)
变化。(东仁公司,日本)对细胞黏附的数量进行评估。
在每个样品孔中加入500μL新鲜配制含10%的
1材料和方法CCK-8试剂的OKM培养液,然后在细胞培养箱中
继续避光培养2h。最后,轻轻水平摇晃孔板混匀
,从每个孔中吸取100μL溶液到无菌96孔
本研究使用的四级工业纯钛(成都欣航丰科板内,每个样品孔均设置3个复孔,测定在450nm
技有限公司),,厚度为处的光密度(opticaldensity,OD)值。
。它们依次经粒度200、400、600、800、
1200和2000号的SiC砂纸进行打磨抛光,然后在将接受最佳NTAP处理时间(Plasma组,结果
超声震荡下,用***、75%)或未接受NTAP处理的HGECs(Control
处理15min,重复3次。最后,样品在60℃真空组)以密度为每毫升1×105个接种于24孔板的钛表
干燥,消毒24h后备用。面,,分别培养4、12、24和48h。
,用PBS洗涤3次。使
HGECs购自于上海沪震生物科技有限公司,用CCK-8对细胞进行评估。采用CCK-8标准操作
在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室培养和对结果进行检验。
保存。HGECs在口腔角质细胞培养基(oralkerati‐
nocytemedium,OKM)(ScienCell公司,美国)接受最佳时间处理的Plasma组和Control组的
中培养,加入1%青霉素/链霉素溶液(Hyclone公HGECs接种于24孔板的钛表面,细胞密度为每毫
司,美国)。这些细胞在37℃、5%CO的孵箱中升1×105个,分别在培养4、12、24、48h时间点
2
传代培养。取生长状态良好的2~3代,%%戊二醛溶液固定12h,PBS冲洗3次。然后
溶液进行消化,放置于孵箱中1min后加入含血清在乙醇(35%、50%、75%、85%、95%、100%)
的培养基终止消化,1000r·min-1下离心5min,弃中依次脱水,每次10min。脱水后使用醋酸异戊
上清,培养基重悬,显微镜下计数板计数,调整脂溶液进行置换,临界点干燥后对样本进行喷金
细胞浓度至每毫升1×105个,接种于35mm培养皿处理,最后将处理完成的样本放置于SEM下观察
并加入适量OKM培养基。细胞的黏附形态。细胞附着于钛表面是实现软组
。
体研究中心研发制造并提供。以氩气(Ar)作为接受最佳时间处理的Plasma组和Control组
−
载体,流速3000sccm·min1。氧(O)作活性气HGECs分别以细胞密度为每毫升1×105个接种于6
2
−
体,流速30sccm·min1。开启电源启动装置,混孔板的钛表面,分别孵育4、12、24、48h。取出
合气体经设计的手柄喷嘴生成非热等离子火焰。在相应培养时间点的孔板置于冰上进行操作。使用
细胞处理过程中,每次实验直接在培养皿中照射细Trizol(北京索莱宝科技有限公司)法裂解细胞并
胞。培养皿中含有相应密度(每毫升1×105个)的提取总RNA。使用PrimeScriptRTMasterMix
细胞悬液。直径35mm的培养皿中加入3mLOKM(TaKaRa公司,日本)逆转录合成cDNA,然后使
培养基,NTAP处理时,手柄喷嘴距离培养皿约用LightCycler480(Roche公司,瑞士)与SYBR
Ⅱ
10mm。处理的过程中呈Z形匀速移动手柄喷嘴,PremixExTaq(TaKaRa公司,日本)进行实时
尽可能地达到均匀处理。照射后将细胞悬液混匀,荧光定量聚合酶链式反应(quantitativereal-time
接种于相应已放置钛片的孔板。polymerasechainreaction,qRT-PCR)。以HGECs
,采用Lamininα3、Integrinβ4和
HGECs分别经NTAP处理0、10、20、30、60sPlectin特异性引物进行聚合酶链反应(polymerase
后,接种于已放置钛盘的24孔板,细胞密度为每chainreaction,PCR),磷酸甘油醛脱氢酶(glycer‐
毫升1×105个,加入1%青霉素/链霉素双抗溶液。aldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)为内
各组细胞分别孵育4和24h。在预设的时间点去除参,所用引物序列见表1。
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表1qRT-PCR的引物序列(Bio-Rad公司,美国)溶液显影,然后在膜上曝
Tab1PrimersequencesforqRT-PCR光1min,采集条带,采用quantityone分析胶片的
基因引物序列灰度值。
Lamininα3Forward:5’-CCTCTATGAACAGTGAGGCAGGTG-3’
Reverse:5’-GATGCAGAGTGTGCTGTTTAATGGA-3’
Integrinβ4Forward5’-CCACGTCTTTGAAGGTGAGCTG-3’
:析。采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分
Reverse:5’-ACCCGGAACACATAGGAGTGGTTA-3’
析,然后采用StudentNewmanKeuls(ANK)方法
PlectinForward:5’-TGGTGAACATCAGGAATG-3’
Reverse:5’-GCAGAATGATTGTCCAGA-3’确定多重比较的显著性差异。P<
GAPDHForward:5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’计学意义。
Reverse:5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’
Plasma组和Control组的HGECs接种于直径为
。同样,细胞培养4、12、
−
24和48h后。样品用PBS洗涤,用含有1mmol·L1不同NTAP处理时间下HGECs在钛表面的黏
苯***磺酰***(phenylmethanesulfonylfluoride,附结果见图1。培养4h时,与0s组相比,10、
PMSF)(北京索莱宝科技有限公司)的RIPA裂解20、30s组细胞黏附数量明显增加。然而,60s组
液(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)(北京出现了下降。不同组间,20s照射对促进细胞黏附
索莱宝科技有限公司)吹打裂解,BCA法测定蛋作用最大,与其他组比较差异有统计学意义(P<
白浓度。将蛋白样品转移到聚偏***乙烯(polyvi‐),±,而对照组OD值为
nylidenefluoride,PVDF)膜(Roche公司,瑞士)±。培养24h时,HGECs黏附数量增加趋
上、5%脱脂牛奶在TBST缓冲液中封闭2h,然后势相似,HGECs黏附在20s处理时达到最大值,
用抗Lamininα3、抗Integrinβ4或抗Plectin在4℃±,与其他组比较差异有统计学意
下孵育过夜。用TBST冲洗,然后用相应的二抗义(P<)。以上2个时间点的细胞培养结果显
IgG-HRP(上海Abcam公司)室温孵育1h。最后,示,HGECs在照射20s时黏附数量达到最大,因
用电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)此选择20s作为下一次实验的最佳处理时间。
左:培养4h;右:培养24h。不同字母表示组内差异有统计学意义(P<)。
图1不同NTAP作用时间对HGECs黏附的影响
Fig1EffectsofdifferentNTAPtreatmenttimeontheadhesionofHGECs
、、
20s为实验的最佳处理时间,。
用20s处理时间。随着培养时间的延长,
HGECs在钛表面上的附着和生长均不断增加,呈SEM观察不同组HGECs黏附在钛表面不同的
时间依赖性。Plasma组细胞黏附率显著高于对照细胞形态。培养4h,2组细胞均呈收缩聚集状,
组(P<)(图2)。实验结果表明,NTAP处理黏附面积小,黏附松散,胞体无细胞伪足伸出。
后培养4、12、24、48h,HGECs在钛表面上的黏培养12h,2组进一步伸展,但Plasma组细胞显示
第3期张敏,等:低温等离子体促进人牙龈上皮细胞在钛表面的黏附•289•
较大粘连面积。在更高倍镜的视野下观察,细胞达在NTAP处理后显著增加。在4~48h,2组间差
显示出更大的伸展面积,细胞更加扁平,周围更异均有统计学意义。在孵育4、12、24和48h后测
多的丝状伪足锚定在钛片表面。培养24和48h,2定Plectin的表达,NTAP处理增加其表达水平,趋
组HGECs均进一步伸展,表现为不规则的多边形,势同Lamininα3和Integrinβ4。
有更多的触角和伪足。Plasma组的HGECs比对照
组显示铺展面积更大,伪足数量多和广泛的细胞
相互连接(图3)。
-PCR评价Lamininα3、Integrinβ4和Plec‐
tin基因的表达
HGECs黏附在钛表面上4、12、24和48h的
Lamininα3、Integrinβ4和Plectin基因表达分析结
果见图4。与Control组相比,Plasma组Lamininα3
mRNA表达明显增加。12、24和48h时,可以观
察到相似的表达结果,且Lamininα3mRNA表达*P<。
均持续升高。Integrinβ4是HGECs黏附早期表达图2HGECs在钛表面培养不同时间的黏附
的标记基因。在不同的时间内,Integrinβ4基因表Fig2AdhesionofHGECsontitaniumsurfaceatdifferenttimes
图3SEM观察HGECs细胞的形态
Fig3SEMobservationofthemorphologyofHGECs
左:Lamininα3;中:Integrinβ4;右:Plectin。*P<。
图4qRT-PCR检测HGECs的基因表达水平
Fig4GeneexpressionlevelsofHGECsdetectedbyqRT-PCR
、Integrinβ4和HGECs中Lamininα3、Integrinβ4和Plectin的蛋白
Plectin的表达表达水平(图5)。首先培养4h时,Plasma组的3
黏附钛表面的细胞通过Westernblot分析组基因的表达量均高于Control组,条带灰度定量
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、。培养12h时,著上调HGECs中早期(12h)的Lamininα3、Inte‐
Plasma组Lamininα3、Integrinβ4和Plectin分别增grinβ4和Plectin的表达水平,结果与基因表达基
、。然而,考虑到NTAP的作用本一致。后期差异不明显,可能提示:细胞内的
时间较为短暂(仅20s),24h和48h组的差异则蛋白并非单一因素(NTAP)调控,深入的调控机
不如早期阶段明显。与对照组相比,Plasma组显制还需要进一步研究。
图5Westernblot检测HGECs不同时间的蛋白表达水平
Fig5WesternblotdetectionofproteinexpressionlevelsinHGECsatdifferenttimes
黏附。研究[29]表明β4在参与细胞间、细胞与基质
3讨论间的行为调控比α6更具有重要作用。Plectin是一
种相对分子质量为500000膜蛋白,是细胞骨架多
一直以来,众多学者都认为骨结合的成功是功能的连接剂,调节微丝、微管、中间丝的锚定
种植体的存活准则。但近来,越来越多的临床证功能,与上皮层的基底膜细胞层具有广泛的联
据表明,健康稳定的种植体周围软组织结合同样系[27]。它们一起构成类似HDs和IBL的结构,有助
是重要因素。第一道生物屏障的生物封闭能抵抗于PIE固定在种植体表面。
细菌及其代谢物的侵袭,有利于其下方的骨结合本研究采用一种新的方法体外处理HEGCs,
的稳定,保证种植的长期成功率。种植体周围的并在分子和细胞水平上检测细胞的变化。在本实
上皮封闭主要是通过PIE黏附在钛表面形成,其黏验中,钛片模拟种植体的穿龈部分的纯钛基台。
附数量的多少和紧密程度与封闭能力密切相关。当HGECs与钛表面发生接触时,细胞会发生一系
在种植体周围上皮封闭的细胞黏附过程中,列的生理反应,如细胞黏附、伸展和迁移等。而
参与的主要黏附蛋白为Laminin332(又称Lami-这其中,细胞黏附发生得最早。选择Ar作为载气,
nin-5)、Integrinα6β4和Plectin。Laminin332主要这与以往的研究[30]报告一致:大多数等离子体射
由α3、β3和γ2三条链组成。研究[27]表明,在La-流装置使用惰性气体(He或Ar)作为工作气体,
minin332的组装过程中,β3γ2二聚体首先在细胞通常掺杂少量分子气体(N、O)。NTAP处理后,
22
内合成,然后再与α3基团进行整合形成三聚体。细胞发生黏附、伸展、连接、分泌等一系列生理
因此,α3基团的合成是Laminin332三聚体组装过反应。一般来说,低剂量具有杀菌、刺激细胞、
程中的关键因素,提高α3的表达可促进细胞内促进增殖和迁移。Kalghatgi等[31]报告说,低剂量
−
Laminin332的合成。PIE形成早期,Laminin332NTAP(30s或4J·cm2)对内皮细胞相对无损伤,
−
在上皮与结缔组织交界处,而有研究[28]发现PIE形而长时间暴露(60s或8J·cm2)会导致不可逆且
成后,可在上皮与种植体之间检测到其存在,推永久性的细胞损伤甚至死亡。Lou等[11]研究表明,
测Laminin332可引导上皮向种植体表面迁移,形等离子体(,与培养基表面距
成HDs并促进生物学封闭。而Integrinα6β4是一种15mm,He/Ar混合比例为10∶1)能有效激活细
非共价异二聚体,是HDs的跨膜部分,也是