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细胞中加入1%的甲醛,8ml的培养液加入216 ul的甲醛,37度十分钟。
配制含有蛋白酶抑制剂的PBS20ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml
将细胞拿出来,迅速的移除含甲醛的培养基,加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。胰酶消化20秒,加入含蛋白酶抑制剂的PBS1ml。用细胞刮刀把细胞刮下,。
4度2000rpm离心10min,弃上清液,加入200ul含蛋白酶抑制剂的SDS溶液。吹打重悬细胞,冰上孵育10分钟。
超声切割DNA,总切割时间4min30sec,超声10sec,间隙10sec。
4度13000rpm离心10min,转移上清液到一个新的2ml的离心管,弃沉淀。
稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液,,达到最终体积2ml。
为去除非特异性,加入75ul的SalmonSpermDNA/ProteinAAgarose-50%Slurry,4度旋转30分钟。
1000rpm离心3min沉淀SalmonSpermDNA/ProteinAAgarose-50%Slurry,收集上清液。
上清液加入1抗,4度振荡过夜。
加60ul的SalmonSpermDNA/ProteinAAgarose-50%Slurry,沉淀抗体/抗原复合物,4度旋转一小时。
1000rpm4度3min收集沉底,移除上清液,开始洗脱过程。
低盐免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀
高盐免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀
Licl免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀
TEBuffer,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀,两次
现在得到的是proteinA/antibody/histone/DNAcomplex,新制备elutionbuffer(1%SDS,)。加250ulelutionbuffer到沉淀,混匀后室温旋转15min。1000rpm离心3min沉淀,移上清液到新的离心管,重复上面的过程,最后上清液体积大约500ul。
加入20ul的5M的nacl反转交联,65度过夜。
加10µ,20µl的1MTris-HCl,µl的10mg/ml的ProteinaseK到液体。45度旋转一小时。
加入等体积的苯酚/***仿抽提DNA,5000g离心10min,收集上清液,不要吸到丝状蛋白。
,沉淀DNA,5000g离心10min,收集沉淀,用70%的酒精洗涤,开盖晾干。
用10ul的TE缓冲液溶解。测浓度。
开机预热半个小时,加入200ml的TE缓冲液调零,倒掉。加入198ml的TE缓冲液和2ml的样本,测260nm的吸光度。得出值是ug/ul