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红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验
流感病毒表面的血凝素(HA)蛋白,含有识别和结合宿主细胞表
面受体的结构,
毒按适当的比例混合后,由于病毒的作用使红细胞发生凝集,此为凝
集现象。含有特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清,能抑制红细胞凝
集现象的出现,即抗体与病毒结合后,可以使血凝素不能吸附于红细
胞表面的受体上,此为红细胞凝集抑制(HAI)。
微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/
亚型及分析流感病毒HA抗原性变异的试验方法,也可以用于对一般
人群抗体水平的检测和疫苗效果的评价等方面。
用于HAI试验的标准参照血清必须及时更新,用于鉴定流感病
毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清,可以
用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清;用于抗原分析的抗血清建
议包括同一型别和亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清,由于用雪貂
制备的抗流感病毒血清特异性高,易将不同毒株间抗原性差异显示出
来,因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。HAI试验中所用的血
清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素.
(一)生物安全要求
所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行,必
须遵守生物安全规定,严格执行标准操作规程和废弃物管理规定,做
好个人防护要求。季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流
感病毒操作可以在BSL—2实验室里进行,高致病性禽流感病毒的操:.
作在BSL-3级实验室中进行。
(二)实验所用试剂
:以国际疫苗株和国内流行株作为标准参考抗
原,新分离的毒株作为待测抗原.
:以国际疫苗株和国内流行株制备的抗血清作
。
(三)其他试剂/材料/仪器
。4的PBS缓冲液
(日本生研)
(37℃,56℃)
、单道可调加样器
(使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底
板,使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板)
µL、1000µLTIP头、水槽
表1。流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较
红细胞火鸡豚鼠人“O”型血
终浓度0。50。50。5
孔底部形状V型U型U型
45—60mi
孵育时间25—30min45—60min
n:.
细胞沉积成点状,倾
细胞沉积细胞沉积成
红细胞沉积形状斜时细胞向下流成泪
成环状环状
滴状
(四)流感病毒鉴定和抗原分析步骤
(1)标准参考抗血清的处理
1)去除血清中的非特异性抑制素
a)所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与
红细胞表面受体相似的物质,它们能与红细胞受体一起
竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。目前所知道
的非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特
殊的非特异性抑制素,还有三种:α、,
必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确
地测定出HAI的抗体效价。常用的清除非特异性血凝抑制
素的方法有霍乱滤液(RDE,受体破坏酶的一种)清除法,
过碘酸钾清除法等。
b)RDE处理步骤:用25mL生理盐水稀释RDE;在1体积血清
中加入3体积RDE(+),37℃水浴
16-18h;56℃水浴30min;加入6体积生理盐水(在0。
4mLRDE和血清混合物中加入0。6mL生理盐水).
2)去除非特异性凝集素
a)向20体积RDE处理后的血清中加入1体积的纯血球。
b)完全/彻底混匀,在2-8℃孵育,每15min重新混匀一次。:.
c)1h后,2000转离心5min。吸出血清上清液.
d)取出一块96孔血凝板,在第一列每孔加入50uLPBS缓冲
液,吸出50uL处理好的血清,做2倍稀释,加入50uL红细
胞悬液,室温静置30-60min,观察试验结果,如果红细胞
沉积,证明血清中非特异性凝集素去除干净(去除非特异
性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致)。
(2)红细胞悬液配制
1)A。。05g、
柠檬酸钠0。8g、柠檬酸0。055g、***化钠0。42g、去离子水
加至100mL,微热溶解,,8磅20min高压灭菌,
4℃贮存备用.
2),离心5min(火鸡/鸡红细胞
1800rpm;人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm,不同离心机转速稍有
不同),弃上清.
3)加入等量的PBS缓冲液洗涤,充分混匀,离心5min(转
速同上),。最后一次洗涤后,
离心10min(转速同上),弃上清。
4)吸出适当体积的红细胞,用PBS缓冲液配制成工作浓度
为1%红细胞悬液。
(1)在微量血凝板的第2~12列加入50µLPBS缓冲液。
(2)在第一列(A1~G1)中加入100µL病毒悬液。:.
(3)H1加入100µLPBS,作为红细胞阴性对照。
(4)从第一列各孔吸50µL病毒液,由第1列至第12列做2倍系
列稀释,最后一列每孔弃去50µL。
(5)在每孔中加入50µL红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀.
(6)室温孵育,鸡和火鸡红细胞静置25-30min后观察结果,人
“O”型和豚鼠红细胞45—60min后观察结果,并记录。
引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“+"记录;只有部分红细胞凝
集记录为“+/-”;无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现完全凝集的
最高稀释度为终点,其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度.
表2。HA滴度判定举例
病毒稀释度
HA滴
1:1:1:1:1:1:31:1:121:1:511:1:
度
1248162648256210242048
123456789101112
A++--—-—--—--2
B++++-——-----8
C+++++--—-———16
D++++++—-——-—32
E+++++++——---64
F++++++++——-—128
G++++++++++++≥2048
H----———-—-—-<1
(1)一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的:.
毒量。
(2)制备4个单位血凝抗原时,首先计算出红细胞凝集抑制
试验所需的病毒抗原的总量。如每种血清做8孔稀释,每孔用
抗原25µL,。根据标准抗血清的
份数计算出实验所需病毒抗原总量。
(3)其次,计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以8,得
,某病毒的HA
滴度为64,除以8等于8,则1:8(1mL病毒液加7mLPBS缓冲液)
稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原.
注:红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25µL病毒
液中含有4个血凝单位(等于50µL病毒液中含有8个血凝单位)。
µL时,4个血凝单位配置对照表
HA滴度病毒液(µL)PBS(µL)
16800800
324001200
642001400
1281001500
256501550
512251575
。5
20486。251593。75
(1)为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准:.
确无误,新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。操作方法同
HA实验步骤。
(2)如果只有前4孔出现凝集,表明每50µL病毒含有8个血凝
单位,该病毒稀释准确,可以用于红细胞凝集抑制试验。如
第5孔也出现凝集,说明每50µL病毒含有16个血凝单位,该抗
原必须等量稀释。如只有前3孔凝集,表明每50µL病毒仅含4
个血凝单位,病毒量需加倍。此外,4个血凝单位抗原必须每
次现用现配。
(HAI)
(1)利用HAI方法进行流感病毒的鉴定
红细胞凝集抑制试验(HAI)鉴定未知病毒,每块96孔血凝
板可以检测两株未知病毒.
1)在血凝板的第1-5、7—11列每孔加入25µLPBS缓冲液,
第6和12列每孔加入50µLPBS。然后在A1—A4、A7-A10
各孔分别加入:抗A(H1N1)pdm09流感病毒标准参考血清、
抗季节性A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗B—Yamagata
系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参
考血清25µL,用多道移液器从A1—A4、A7—A10行每个
孔分别取25µL,由A至H行做2倍稀释血清,最后一行弃
去25µL.
2)第1至4各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原1,A7至
A10各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原2。第5和第:.
11列加入25µLPBS缓冲液,作为红细胞对照。第6和第12
列第一孔分别加入50µL8血凝单位待检抗原1和2,由A
至H行做2倍稀释,最后一行弃去50µL,此处做法的目的
是HAI实验同时验证所配置4单位抗原的准确性,确保实
验结果准确。
a)阳性对照:将试剂盒中的各型/亚型流感病毒标准参考抗
原按照上述步骤进行检测.
3)轻拍,混匀,室温孵育30min。
4)每孔加入50µL配置好的红细胞悬液,轻拍混匀,室温静置
30-60min,观察血凝抑制实验结果(具体孵育时间根据使用的
不同种类血球来定,详见表1).
(2)利用HAI方法进行流感病毒的抗原分析
1)验证4血凝单位抗原步骤同以上,如果4血凝单位结果不
准确需重新配置,直至回滴结果准确为止,在进行抗原分析
时4血凝单位抗原一定要配制准确,保证病毒之间抗原分析
结果有可比性.
2)在微量血凝板的第1-11列每孔加入25µLPBS缓冲液,第
12列每孔加入50µLPBS缓冲液。在第一行(A1-A11)每孔
加入25µL对应待检流感病毒型/亚型的抗原分析用参考抗
:.
3)从第一行(A1-A11)各孔混匀之后吸取25µL血清,由第
1行至第8行做2倍系列稀释,最后一行每孔弃去25µL液
体。
4)在微量板的第1-11列每孔加入25μL配制好的4血凝单位
抗原,第12列A12孔加入50µL配置好的8血凝单位抗原,
由第1行至第4行做2倍系列稀释,最后一行每孔弃去50µL
液体。第12列的E、F、G、H孔做红细胞对照,轻拍微量
板,室温孵育30min。
5)在微量板的每孔加入50µL的红细胞悬液,轻拍微量板,
使红细胞与病毒充分混合。
6)室温静置30-60min(具体孵育时间根据使用的不同种类血
球来定,详见表1)。观察血凝抑制实验结果.
红细胞凝集抑制效价是指血凝现象完全被抑制时血清的最高
稀释度的倒数。如1:80稀释的血清孔不出现凝集(凝集现象完全被
抑制),1:160稀释的血清孔出现凝集(凝集现象没有被完全抑制),
该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。
(1)利用HAI方法进行流感病毒鉴定的结果判断
1)标准参照抗血清对待检抗原的抑制效价≥20才可以算为阳
性。:.
2)待检抗原与标准参照抗血清有交叉抑制,但与一种型/亚型
的标准参照抗血清抑制效价大于其他型/亚型参照抗血清4
倍以上时,便可以判定为此种亚型的流感病毒.
(2)利用HAI方法进行流感病毒抗原分析的结果判断
1)当待检病毒与参考雪貂抗血清的HAI效价低于参考病毒与
参考抗血清自身HAI效价的8倍(含8倍)或以上时,则认
为待检病毒是该参考抗血清检测到的低反应株;反之,当相
差8倍以内时(不含8倍),则认为待检病毒是参考病毒的
类似株。
2)抗原分析试验时,每次都必须同时加入标准参考抗原进行
检测,它既是结果判读的依据,也是试验的质控。确保实验
结果准确,
价上下一孔浮动,在试验质控的范围内,如果超出此范围之
外本次试验结果不成立,需重复试验。
(五)注意事项
µL的抗原,抗
原必须现用现配。
。
,避免反复冻融及污染。
,保存。
:
(1)红细胞对照,用于准确判断读结果的时间,同时排除血:.
球问题引起的错误结果;
(2)阴性对照血清,以防其它非特异性抗体的影响;
(3)阳性对照:防止非特异性凝集素及抑制素的干扰;结果判
读标准。