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真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法.docx

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真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法.docx

文档介绍

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真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法
本发明提供一种真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法,具体包括RSIV的原料选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等过程。所述标准样品的制备方法包括:由RSIV病毒液中提取病毒DNA、PCR反应扩增并纯化目的基因片段、目的片段的连接转化;回收质粒的步骤。本发明的真鲷虹彩病毒标准样品稳定性高、均匀性好,为真鲷虹彩病毒的检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求,同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。使用本发明的标准样品可以实现不同实验室结果的比对,从而保证实验室的质量控制。
【专利说明】真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法【技术领域】,具体涉及真鲷虹彩病毒标准样品及其制备方法。
【背景技术】
[0002]我国是世界上最大的水产品生产和输出国,目前,我国水产品总量已占全球渔业总产量的40%,连续15年居世界首位,养殖水产品产量占世界养殖总产量的70%。水产品在保障国家粮食安全、促进农民增收和农村经济稳步发展中发挥了重要作用。我国水海产品出口面临的壁垒主要为绿色壁鱼,如日本的
“肯定列表制度”、欧盟的《欧盟食品及饲料安全管理法规》及有关法令、美国的《最严谨的水产养殖规范》(BAP)等,欧盟启动了对我国进口人工养殖海产品的审查;韩国政府也禁止我国34家水产养殖企业向韩国出口鱼类等水产品,严重制约了我国水产品的出口增长。
[0003]真觸虹彩病毒(RedseabreamiridovirusRSIV)属于虹彩病毒科Iridoviridae,细胞肿大病毒属Megalocytivirus(),是在养殖的海水鱼中经常发生并且危害较大的病毒病。该病首次报导是1990年,在日本四国的真鲷养殖场,养殖的真鲷大量死亡。自1991年,该病就在日本西南部的18个区流行并造成20多种养殖的海水鱼群严重损失。受感染的包括鲈形目、鲽形目和飩形目的鱼。引起养殖鱼群主要是真鲷鱼苗的大批死亡。不过也有关于商品规格的鱼死亡的报导。此后就在各种海水养殖鱼类中流行并造成很大的损失。1998年该病在南韩流行,引起60%的鲷鱼和鲈鱼死亡。现在已经传到台湾,据报道使养殖的石斑鱼损失很大。我们曾经从自台湾和泰国进口过来的鲈鱼中检出过RSIV,由于该病毒造成的危害极大,OIE列为重要传染病。
[0004]由于养殖生态环境恶化,疾病预防意识差,滥用药物普遍,水生动物种苗质量不高,防疫体系不健全等原因导致水生动物发病。系统内送检鱼的样品通常眼观来看都比较健康,而真鲷虹彩病毒通常只有在适宜的温度下才能发病,而且现在用的
PCR方法只能从重度感染表现出临床症状的鱼中检出病毒,无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大,检验流程时限要求缩减,鱼类疫病多数要细胞进行先增殖,而普通的水生动物疫病实验室很难得到该病毒,对实验室的质量控制及研究带来了极大的挑战。
[0005]为了帮助实验室建立好的质量保证,辽宁出入境检验检疫局从2006年就开始从事水生动物疫病及标准样品的研究工作。本标准样品的研制成功,不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求,同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种稳定性高、均匀性好的真鲷虹彩病毒分子标准样品及其制备方法。
[0007]为了得到所述真鲷虹彩病毒分子标准样品,根据真鲷虹彩病毒(RSIV)DPO基因部分序列,设计特异性引物,其碱基序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。
[0008]本发明的真鲷虹彩病毒分子标准样品,采用如下方法制备:
[0009](I)采集感染真鲷虹彩病毒的鱼组织,经剪碎、研磨、得鱼组织匀浆液;
[0010](2)将鱼组织匀浆液加入到长成单层的GF细胞中,吸附I小时后,加入培养基继续培养、待细胞感染病毒脱离时,回收细胞经反复冻融、离心得细胞上清液;
[0011](3)步骤(2)得到的细胞上清液中提取得到病毒DNA;
[0012](4)步骤(3)的病毒DNA作为PCR反应模板,进行PCR扩增反应,其中PCR反应的正反引物分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2;
[0013](5)将步骤(4)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中,连接产物转化至感受态细胞后,LB平板培养,筛选得到阳性克隆;
[0014](6)阳性克隆中提取得到质粒,即为真鲷虹彩病毒分子的标准样品。
[0015]上述制备方法中,所述GF(Gruntfin)细胞系为石鲈鳍细胞系,由ATCC购买。
[0016]上述制备方法中,在步骤(2)中所述培养基为L-15培养基;在步骤(5)中筛选阳性克隆的方法为PCR方法,其中PCR反应的正反引物分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。
[0017]上述制备方法中,在步骤(1)中所述的鱼组织包括脑、肝、肾和脾。
[0018]本发明的真鲷虹彩病毒分子标准样品稳定性高、均匀性好,为真鲷虹彩病毒的检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求,同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。使用本发明的标准样品可以实现不同实验室结果的比对,从而保证实验室的质量控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中RSIV目标基因的PCR扩增反应产物的电泳图,其中M:DL2000Marker,1:PCR扩增产物扩增出568bp大小的片段,2:阴性对照;
[0020]图2为实施例1中RSIV目标基因的PCR扩增反应产物的电泳图,其中M:DL2000Marker,1:PCR扩增产物扩增出911bp大小的片段,2:阴性对照;
[0021]图3为实施例1中用PCR方法筛选的阳性克隆PCR扩增产物电泳图,其中M:DL2000Marker;1:阴性对照;2,3:阳性克隆PCR扩增产物扩增出911bp大小的片段。
【具体实施方式】
[0022]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
[0023]本发明中使用的GF(Gruntfin)细胞系由ATCC购买;L-15培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。、PCR试剂盒、分子量标准DL-2000、DNA快速纯化回收试剂盒、DN***段的连接转化试剂盒等均为TaKaRa公司产品;氨苄青霉素(Amp)为上海生工生物工程有限公司产品;其余试剂均为分析纯产品
O
[0024]根据真鲷虹彩病毒(RSIV)DPO基因部分序列,设计特异性引物,由宝生物公司合成,序列如表1,利用该特异性引物扩增911bp大小的片段。
[0025][0026]
一77扩增片段长
基因名称序列5'-3'、____1..U:bp
正向引物
RSIV-FIATCGTCCGGGGCTACCCTT

--911
DPO基因反向引物
RSIV-
[0027]实施例1真鲷虹彩病毒分子标准样品的制备
[0028]
[0029]。
[0030](I)组织病料的处理
[0031]取被真鲷虹彩病毒感染的病鱼50mg组织样品(包括脑、肝、脾和肾),加入150μLCTAB溶液,用小剪刀剪碎,研磨匀浆成糊状,即得到病鱼组织匀浆液;
[0032](2)DNA的提取:在步骤(1)得到的病鱼组织匀浆液中,加入
CTAB溶液(按2%CTAB,
,20mmol/LEDTA,20mol/LTris-,%。)至800μL,25°C、放置2h,加350μL抽提液I(按体积比配制,三***甲烷:异戊醇=24:1,密封避光保存),充分混合,12000r/min离心5min,取最上层水相,再加350μL抽提液II(按体积比配制,Tris饱和酚:三***甲烷:异戊醇=25:24:1,密封避光保存。),充分混合,12000r/min离心5min,取最上层水相,,_20°C沉淀过夜。置12000r/min离心30min,弃上清,干燥,加10μL水溶解后,作为下步PCR反应模板DNA。
[0033]PCR反应体系:反应管中加入模版DNA2μL(),Taq酶用10倍缓冲液10μL,,dNTPs2μL,rTaq酶IμL,DEPC水至100μL。
[0034]引物Fl序列:CGGGGGCAATGACGACTACA
[0035]引物Rl序列:CCGCCTGTGCCTTTTCTGGA
[0036]PCR反应条件-MV,4min;94°C,lmin,58°C,lmin,72°C,lmin,30个循环;72°C,IOmin;4°C保温。
[0037]反应结束后,%琼脂糖凝胶电泳鉴定,如图1。图1中,M:DL2000Marker,1:PCR扩增产物扩增出568bp大小的片段,2:阴性对照。图1结果显示,经PCR
扩增,出现了与预期大小一致的568bp的片段。
[0038]将上述扩增获得的大小为568bp的片段,送至大连宝生物公司进行核苷酸序列测定,。
[0039]将所得序列通过NCBI在线nucleotideblast分析,结果表明:该核苷酸序列与真鲷虹彩病毒的核酸序列相似性最高达99%,为真鲷虹彩病毒基因组部分序列。
[0040]
[0041](I)GF细胞的复苏
[0042]从液氮中取出GF(Gruntfin)细胞冻存管,迅速投入37~38°C水浴中,使其迅速溶化。后1000r/min离心5min。吸去上清,加入L-15培养液ImL,吹打混匀。移入25cm2培养瓶中,继续加入含10%胎牛血清的L-15培养液至终体积6mL。放入25°C低温培养箱培养。
[0043](2)RSIV的增殖
[0044]①将在上述步骤I中经PCR鉴定阳性(扩增获得大小为568bp片段)的病鱼组织匀浆液作为RSIV病毒液,依次用含10%胎牛血清的L-15培养液稀释成3个稀释度,1:10;1:100和1:1000。
[0045]②选长满单层的GF细胞4瓶,倒掉培养液,其中I瓶作为对照组,其余3瓶作为3个稀释度的接毒组。
[0046]③接毒组分别加入步骤①中稀释好的ImLRSIV病毒悬液后,置于
25°C低温培养箱中,吸附I小时。
[0047]④补加L-15培养液5mL继续培养,待细胞感染病毒后脱落,出现细胞病变(CPE)后反复冻融细胞培养物三次,于4°C,10000r/min离心IOmin得细胞培养物上清液,备用。
[0048]、克隆与测序
[0049](I)真鲷虹彩病毒基因组的提取
[0050]取800μL由步骤2制备的细胞培养物上清液,,保存至_20°C备用。
[0051](2)目标基因的扩增
[0052]本发明自行设计引物,扩增真鲷虹彩病毒DPO基因部分序列,大小为911bp的片段,将引物稀释至20pmol/yL使用,引物序列如下:
[0053]RSIV-Fl:ATCGTCCGGGGCTACCCTT
[0054]RSIV-Rl:CGCGACGCGCCACCCAA
[0055]以3(I)中提取的基因组DNA作为PCR反应模板,进行PCR扩增反应。
[0056]PCR反应体系:反应管中加入模版DNA2μL(含有4ngDNA),Taq酶用10倍缓冲液10μL,引物RSIV-Fl和RSIV-,dNTPs2μL,rTaq酶IμL,DEPC水至100μL。
[0057]PCR反应条件:94°C,5min;94°C,lmin,
58°C,30s,72°C,lmin,30个循环;72°C,IOmin;4°C保温。
[0058]扩增反应结束后,%琼脂糖电泳鉴定,结果显示(图2),扩增获得了与预期大小一致的911bpDN***段。图2中,M:DL2000Marker,1:PCR扩增产物扩增出911bp大小的片段,2:为阴性对照。
[0059](3)目标基因的序列测定
[0060]将PCR扩增产物送宝生物(大连)有限公司进行测序,。将所得序列通过NCBI在线nucleotideblast分析,结果表明:该核苷酸序列与真鲷虹彩病毒(RSIV)的核酸序列相似性最高达99%,为真鲷虹彩病毒基因组部分序列。
[0061](4)目标基因的纯化[0062]将步骤(2)(货号DV805A),并按其操作说明回收目标分子DN***段,。
[0063](5)目的片段的连接转化
[0064]在步骤(4)中纯化得到的目的片段4μL,2XRapidligationbuffer5μL,PGEM-,,用无菌水补充至10μL,室温连接lh。,轻轻用移液器混匀,冰浴