白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用的制作方法.docx

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专利名称:白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用。
背景技术:
白僵菌素是一种六元环状缩酯肽化合物,由3个***苯丙氨酸和(D)-Ci-羟基异戊酸残基交替相连而成,分子式为C45H57N3O9,分子量为786,结构如图1。白僵菌素是真菌的次生代谢产物,最早由Hamil于1969年首次从球孢白僵菌的菌丝体中提取到。至今为止已经从球孢白僵菌(Beauveriabassiana)和几种其他的真菌中分离得到了白僵菌素。白僵菌素对蚊子幼虫、卤虫、绿头苍蝇和鞘翅目害虫等有杀伤作用。目前,白僵菌素主要用作杀虫剂和除菌剂等。近年来,越来越多的发现表明白僵菌素除了杀虫之外还具有很多生物活性。2000年,Nilanonta报道了其同系物的抗结核和疟原虫的活性。2004年,-1366中分离得到了白僵菌素及其3个同系物,并与咪康唑配合进行了抗白色念珠菌(Candidaalbicans)活性测定,结果表明通过配合白僵菌素使用咪康唑,不仅能够抑制普通白假丝酵母,而且能够有效抑制对咪康唑有抗药性的白假丝酵母。
2004年,Jow等发现白僵菌素能够诱导人白血病细胞的凋亡。2005年,Lin等对白僵菌素诱导人肺癌细胞凋亡的机制进行了研究。然而,白僵菌素对哺乳动物的毒性较大,可影响动物或人类的健康,可引起鼠和人类肿瘤细胞系显著的细胞死亡,并且强效和特异地抑制鼠肝脏微体中胆固醇酰基转移酶活性。2003年,Dombrink-Kurtzman还发现白僵菌素能够诱导火鸡外周血液中淋巴细胞的凋亡,从而影响其免疫系统(Dombrink-KurtzmanMA,2003)。因此,白僵菌素的毒性极大地限制了它的应用。然而,2007年的研究发现低剂量的白僵菌素与***康唑能够产生互动作用(Synergy)杀死病原真菌,大大减少用药量,并降低毒副作用(^iangLX,YanKZ,ZhangY,HuangR,BianJetal.(2007)High-(11):4606-4611.)。另外,在白僵菌中,白僵菌素的产量相对较低,Xu等利用Beauveriabassiana发酵得到约20mg/L的白僵菌素。如上所述,镰刀菌属中的株的白僵菌素的产量比白僵菌属中的产量高23个数量级。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与白僵菌素合成相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与白僵菌素合成相关的蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列13的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与白僵菌素合成相关的由(a)衍生的蛋白质。
本发明所提供的与白僵菌素合成相关蛋白的编码基因,为如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列1第27,092位到36,504位所示的DNA分子;2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因;3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。含有与白僵菌素合成相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种白僵菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇。本发明所提供的白僵菌素合成相关蛋白质系统,是由如下1)至15)中15种蛋白质组成的1)其氨基酸序列为序列表中的序列2或在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列2限定的蛋白质衍生的蛋白质;2)其氨基酸序列为序列表中的序列3或在序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列3限定的蛋白质衍生的蛋白质;
3)其氨基酸序列为序列表中的序列4或在序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列4限定的蛋白质衍生的蛋白质;4)其氨基酸序列为序列表中的序列5或在序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列5限定的蛋白质衍生的蛋白质;幻其氨基酸序列为序列表中的序列6或在序列表中序列6所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列6限定的蛋白质衍生的蛋白质;6)其氨基酸序列为序列表中的序列7或在序列表中序列7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列7限定的蛋白质衍生的蛋白质;7)其氨基酸序列为序列表中的序列8或在序列表中序列8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列8限定的蛋白质衍生的蛋白质;幻其氨基酸序列为序列表中的序列9或在序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列9限定的蛋白质衍生的蛋白质;9)其氨基酸序列为序列表中的序列10或在序列表中序列10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列10
限定的蛋白质衍生的蛋白质;10)其氨基酸序列为序列表中的序列11或在序列表中序列11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列11限定的蛋白质衍生的蛋白质;11)其氨基酸序列为序列表中的序列12或在序列表中序列12所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列12限定的蛋白质衍生的蛋白质;12)其氨基酸序列为序列表中的序列13或在序列表中序列13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列13限定的蛋白质衍生的蛋白质;13)其氨基酸序列为序列表中的序列14或在序列表中序列14所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列14限定的蛋白质衍生的蛋白质;14)其氨基酸序列为序列表中的序列15或在序列表中序列15所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列15限定的蛋白质衍生的蛋白质;15)其氨基酸序列为序列表中的序列16或在序列表中序列16所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与白僵菌素合成相关的由序列16限定的蛋白质衍生的蛋白质。本发明所提供的白僵菌素合成相关蛋白质系统的编码基因簇,为如下1)或2)或3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列
1;2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码白僵菌素合成相关蛋白系统的DNA分子;3)与1)的基因具有90%以上的同源性,且编码白僵菌素合成相关蛋白系统的DNA分子。本发明的又一个目的是提供一种重组载体。本发明所提供的重组载体,为将序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列插入到出发载体上,得到的含有序列表中序列17所示核苷酸序列和序列表中序列18所示核苷酸序列作为上下游同源臂的重组载体。所述出发载体为pRF-HU2克隆载体;所述pRF_HU2克隆载体携带有可以在大肠杆菌中复制的起始位点oriV元件,同时含有广谱宿主性的复制起始基因TrfA,可保证该载体可在各种真菌宿主中扩增(如曲霉、镰刀菌等)。另外,构巢曲霉来源的色氨酸启动子PTrpC和色氨酸终止子TtrpC对筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因hph的功能表达起到重要的作用,潮霉素抗性筛选在真菌分子生物中是很好的遗传标记。本发明的又一个目的是提供一种制备产白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法。本发明所提供的制备产白僵菌素能力降低的基因工程菌的方法,包括如下步骤将所述重组载体导入能生产白僵菌素的真菌中,即得到产白僵菌素能力降低的基因工程菌;所述能生产白僵菌素的真菌为可育镰刀菌(Fusariumproliferatum)LF061。根据所述方法制备得到的基因工程菌也属于本发明的保护范围。本发明所提供的与白僵菌素生物合成相关蛋白质系统及其编码基因簇可以帮助人们理解羧酸肽家族天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
图1为白僵菌素的化学结构。图2为镰刀菌LF061基因组文库筛选三个阳性克隆子在白僵菌素合成簇上可能的排布方式。3个交叠的R)smid黏粒代表了可育镰刀菌LF061基因组431Λ的DNA区域,★代表筛选所用引物,fpBeasLJl,fpBeas5#和fpBeaS8#为筛选获得的三个阳性克隆子质粒。图3为白僵菌素生物合成基因簇的基因组成;每一个箭头代表一个0RF,箭头方向代表转录方向;其中,白僵菌素合酶基因fpBeas,kivr和调节基因orf12用黑色箭头表示。图4为FpBEAS合酶结构示意与提出的BEA的生物合成途径;其中,(I)FpBEAS合成酶结构。modulel=L-苯丙氨酸识别和活化模块;module〗=D-α-羟异戊酸活化模块;S4'-硫酸泛酰巯基乙***结合位点;C:缩合结构域;M:Ν-***转移酶域。(II)推测的镰刀菌中白僵菌素合成机制。图5为重组载体pRF-HU2-fpBeaS的构建过程示意图。图6为重组载体pRF-HU2_fpBeas的示意图。图7为白僵菌素合成基因fpBeas基因的阻断及分子验证;(I)突变子ml中fpBeas基因阻断示意;(II)PCR鉴定突变子(L)HygU/HygL,(M)geneTl/T2,
(R)geneT3/RFl扩增左侧区域和geneT4-RF2扩增右侧区域。图8为可育镰刀菌LF061及突变株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析;(I)野生型可育镰刀菌LF061;(11)突变子ml(fpBeas基因单侧插入阻断);(III)突变子m2(敲除载体异位插入LF061基因组别处位置)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1、可育镰刀菌(Fusariumproliferatum)LF061白僵菌素合成相关基因簇的制备一、可育镰刀菌(Fusariumproliferatum)LF061白僵菌素合成相关基因簇的克隆1、白僵菌素产生菌镰刀菌LF061总DNA的提取将单孢分离纯化的可育镰刀菌(Fusariumproliferatum)LF061菌株(公众可从中国科学院微生物研究所获得,记载过该材料的非专利文献是JhangLX,YanKZ,ZhangY,HuangR,BianJetal.(2007)High-(11):4606-4611.)接种于含IOOmLPDA液体培养基中,28°C,200rpm的摇床上培养3天。过滤出菌丝体,再用无菌水洗涤1-2次,用灭菌的滤纸包住放置晾干。
菌丝体,在液氮中研磨成粉,,加入600μL改良基因组提取液SDS;IOOmMTris-HCl,;IOmMEDTA,;)(Moileretal.,1992),混勻,65°C水浴中保温30min处理。然后将离心管迅速移入冰浴中静置5-lOmin,加入Tris饱和酚和***仿各300μL,充分混勻,室温静置10min,4°C,12,OOOrpm离心10分钟。吸取上清,加入等体积的***仿,混勻,4°C,12,OOOrpm离心lOmin。继续吸取上清,加入1/10体积的3M的NaAC(ρΗ6·0)和3/5体积的异丙醇,混勻,室温静置lOmin,4°C,12,OOOrpm离心5min后用70%乙醇洗涤一次。12000rpm离心^iiin弃上清,晾干后加入100μL无菌去离子水,加入2μL的Rnase(10mg/mL),37°C保温20min。2、白僵菌素产生菌镰刀菌LF061基因组文库的构建将上述提取的总DNA进行脉冲场琼脂糖凝胶电泳,电洗脱纯化回收36-451Λ大片段DNA,用CopyControlTMFosmidLibraryProductionKit的End-RepairEnzymeMix进行末端补平。,换30%PEG8000浓缩DNA。紫外分光光度计测定DNA浓度,按插入片段分子数pCC2F0S载体分子数110的比例以i^ast-LinkDNALigase室温2小时进行连接。,换30%PEG8000浓缩DNA。取10μL连接后的DNA力口入至IJ25μL冰上融化的MaxPlaxLambdaPackagingExtracts,
30°C,90分钟温育后加入另外25μLMaxPlaxLambdaPackagingExtracts,30°C,90分钟温育,加入PDB缓冲液至终体积lmL。取大肠杆菌EPI300-T1K单菌落接入LB液体培养基220rpm,37°C过夜培养进行活化。5ml过夜培养物加入到50mL新鲜LB培养基(含IOmMMgSO4),37°C,220rpm振荡至OD6tltl=-。取50μL包装后混合物加入950μL上述培养的大肠杆菌,37°C,20分钟温育。/!^***霉素的1^培养基,371过夜培养计算文库克隆数;剩余菌液加入终浓度20%的甘油,储存于-80°C。三、PCR克隆白僵菌素合酶A-domain合成基因简并引物设计进行的菌落PCR筛选法是筛选基因组文库最常用的一种方法。,而且后者产生次生代谢产物恩链孢菌素(ermiatin)与白僵菌素同属NRPs—类,结构相近。(CAA79MQ中腺苷酸模块EA结构域保守区域氨基酸序列作为探针,在NCBI上blastP比对搜索,选取近源的NRPk序列,用Genedoc软件比对。以恩镰孢菌素合酶ESYNl中EA模块中的A-domain的保守序列设计简并引物,以FusariumprolferatumLF061的总DNA为模板,克隆负责催化识别D-Hiv的腺苷酰化结构域基因。PCR体系包括DMSO(8%,v/v),dNTP(),Taq聚合酶缓冲液(10X),简并性引物(30mM)