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登革出血热病毒i型核酸分子特征标准样品及其制备方法
本发明公开了一种登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品的制备方法,通过序列的合成、克隆载体、目的片段和载体的连接、质粒转化以及重组质粒的提取、冻干保存等步骤制得登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品,本发明制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品;本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好,并且制备方法过程简单,可以为登革出血热病毒I型检测研究、医用研究等提供标准样品,以实现不同实验室结果比对,从而保证实验室的质量控制;同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对登革出血热病毒I型的快速准确检测提供了标准样品。
【专利说明】登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品及其制备方法,属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]登革热广泛流行于热带和亚热带地区,是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病。在亚洲,太平洋群岛及中、南美洲等许多国家均已造成严重的威胁。第二次世界大战
后,在日本也曾有过流行。近年,在亚洲、非洲和南美洲的热带以及亚热带地区登革病毒感染的发病率呈明显上升趋势。我国于1978年在广东佛山首次发现本病,以后在海南岛及广西等地均有发现。
[0003]目前,登革出血热病毒I型的诊断方法主要由病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、分子生物学等诊断技术。近年来,随着分子生物学技术的发展,实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占很大优势,引起了众多研究者的关注,但现有分子生物学检测试剂盒多为公司根据文献设计阳性对照,没有统一的标准。随着进出口贸易的增大,检验流程时限缩短,难以保证实验室的质量控制。
【发明内容】
[0004]针对上述问题,本发明研制一种登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品,可用于特征序列检测时的阳性对照,以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。
[0005]本发明所述登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品的制备方法,主要包括如下步骤:1)合成病毒序列,:并在每段序列前增加一个T7启动子;2)将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化;3)目的片段和载体的连接反应;4)通过感受态细菌转化质粒;5)重组质粒提取;6)采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测;7)选取纯度和完整性均合格的重组质粒,将溶液混合在一起,并再次测定浓度和纯度,
然后进行分装冻干,将制备好的标准样品置于_80°C冰箱保存。
[0006]上述登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括重组质粒的鉴定:即从步骤4)得到的菌液中取1-3个菌落,接种于含氨苄的LB培养基中培养,提取质粒,然后进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,筛选阳性克隆。
[0007]上述登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括核酸序列测定及序列对比分析:即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。
[0008]本发明所获得的登革出血热病毒I型核酸分子特征标准样品,。而且所述重组载体为质粒。
[0009]进一步地,上述步骤2)所述克隆和胶纯化的具体步骤为:将序列平端克隆入PUC19质粒中;酶切鉴定选择feoR1和油