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专利名称:用核酸或蛋白质进行亚微升级反应的方法和装置的制作方法
技术领域:
本发明属于生物技术领域,涉及制备和进行使用核酸或蛋白质的小规模反应的方法和装置。
背景技术:
联邦政府资助的人类基因组工程其最初目标是在2005年前完***类基因组十次折叠范围内的测序。随着步伐极大加速,最近已有了部分的草图。然而,这项壮举并没有降低对快速、便宜DNA测序的需求,反而刺激了对快速、便宜核酸测序的需求。人类基因组序列草图的完成也刺激了对直接分析基因组所编码蛋白的复杂集合的方法和装置的需求,该集合统称为蛋白质组。
至于DNA测序的需求,对包括细菌、植物及动物在内的非人类生物基因组测序越来越引起人们的注意。
更重要的是,分子病理及药物基因组学领域的发展将需要对来自单个患者的多个基因进行重新测序。分子病理涉及通过鉴定特定基因中的突变对人类疾病作出诊断,也常涉及预后的明确陈述。药理基因组学指推断所有人类总体中所存在的等位基因差异如何影响个体对药物的治疗反应及对副作用的敏感性。
随着个体患者基因测序的需求增长,测序能力的关注点需求也会增长。这就要求只有在得到良好资金资助的学术研究中心及基因组公司才有的、集中的、高通量大DNA测序设备转变成可在大部分医院和诊所安装、不那么复杂的中等通量小基因测序系统。DNA测序技术市场的这种转变将使降低试剂成本并使样品加工步骤尽可能简单和无缝带来额外的费用。
在20世纪70年代末,Sanger等开发出一种DNA序列分析的酶链终止方法,可生成一系列起点相同而在整个的序列的每一核苷酸生成随机结束点的嵌套DN***段。LioydSmith、LeeHood及其它人对Sanger方法作了改动,在测序反应中使用4个荧光标记,使得可以实现单条泳道分离。结果就产生了首台自动化DNA测序仪,它分离时使用聚丙烯酰***板状凝胶。最近,荧光能量转移染料也开始用于制备可使信号增强2到10倍并简化光学配置的染料组合。
自动化荧光毛细管阵列电泳(CAE)DNA测序仪开始成为取代板状凝胶的一致技术。毛细管凝胶电泳加快了测序产物的分离,具有极大降低样品量需求的潜能。AmershamBiosciences公司(Sunnyvale,CA)的商用MegaBACETM是96通道毛细管电泳装置,它使用激光诱导荧光(LIF)共聚焦荧光扫描仪,在90分钟运行及两小时的循环的时间内可检测到平均每毛细管(Phred20个窗口)约625个碱基。共聚焦立体过滤的结果是得到更高的信噪比,因为在光电倍增管
(PMT)进行信号检测前已消除了周围物质过剩的反射和荧光。相应地,每一测序条带的灵敏度均可达到亚阿摩尔(subattomole)水平。共聚焦成像在使用毛细管电泳的微芯片分析系统中也非常重要,因为此时玻璃或塑料的微芯片其背景荧光可能要比熔凝硅石毛细管的背景荧光高得多。毛细管阵列电泳系统可解决基因组领域中许多DNA分析的起始通量需求。然而,目前小体积样品制备的方法仍是增加通量并降低成本的重要障碍。
当荧光DNA测序仪提高DNA序列采集的通量时,它们也将通量瓶颈从序列采集转回到了样品制备。为了适应需要,已开发出象不需离心的磁珠捕获方法那样,快速制备测序模板的方法和转座子辅助的DNA测序方法。已筛选到嗜热ArchaeDNA聚合酶,并将其进行基因改造从而提高保真度,保证高温时的稳定性,增加长度并改变双脱氧核苷酸及荧光类似物的亲和力。这些改进降低了试剂成本,简化了样品制备,使数据精确度更高,阅读长度也增长了。
在测序领域也研发出制备DNA模板、聚合酶链反应(PCR)及DNA测序反应的更高通量方法。使用96孔和384孔微量、多通道移液器及实验室机器人工作站,使样品制备快了许多倍,并实现了自动化。虽然标准的多通道移液器用于操作更小的体积,一般来说这些工作站模仿技术人员所做的操作,工作时的体积最小可小到约
1微升。
用鸟枪法在毛细管系统上进行DNA测序时,典型的全范围样品制备方法开始时将噬菌斑或细菌菌落裂解以分离亚克隆的DNA。在一些情况下,可能需要用PCR扩增亚克隆的DNA插入片段以便指数级地增加其在样品中的浓度。然后,加入外切核酸酶I(ExoI)和北极虾碱性磷酸酶(SAP)进行酶清除反应以除去干扰循环测序的引物和过量的dNTPs。ExoI用于将单链引物降解成dNMPs而不消化双链产物。SAP将dNTPs转化成dNPs,。反应先在37℃进行,然后加热到65℃使ExoI和SAP发生不可逆变性。
因为PCR扩增可以产生循环测序所需的过量DNA模板,测序前可将ExoI/SAP处理过的PCR样品稀释5倍。这样可以将污染浓度降到更少干扰毛细管电泳分析的范围。加入循环测序试剂,一般同时加入荧光标记的染料引物及终止子,反应进行热循环使标记的片段得以线形扩增。最后,在循环后用乙醇沉淀法或旋转过滤法对样品进行处理,重悬于甲酰***中,将另一变性剂或水与样品一起动电注射进毛细管电泳分析系统中。
这样的工作流程使MegaBACETM系统的性能得到极大的改善,目前其它毛细管电泳系统似乎也选用类似工作流程。通过使用来源于单个噬菌斑和人类基因组随机亚克隆集落的真实样品或表达序列标签
(ESTs),这种以线形聚丙烯酰***为分离基质的工作流程其200个碱基对样品的分离成功率从约60%提高到85~90%,其平均阅读长度从约400个碱基增长到超过600个碱基。而且,这种方法已证明是非常稳定的。
尽管上述的样品制备方法已使通量得到很大的提高,试剂的成本仍是测序成本的主要组成部分之一。毛细管电泳只需亚阿摩尔的样品,但目前所制备的样品为皮摩尔级。因此降低反应体积将可以降低DNA测序的成本,并且仍可提供足够的材料用于分析。但是,只有研发出操作、反应样品及试剂令人满意的方法,才能真正减少反应体积。理想的是,这种方法是自动化的,并可配置成同时生成多份样品。另外,将这种方法可作为一个与其它组分如毛细管电泳和分离、分析检测仪整合的模块,将是非常理想的。
已设计了数种装置来辅助样品制备的自动化。例如,第5,720,923号美国专利介绍了一种系统,在该系统中循环反应在直径小到1mm的管子里进行。然后,将这些管子暴露于加热部件所产生的热循环中以完成所需的反应。在单个管子中各加入小量的样品,每个样品在管子中用不与样品组合的液体分隔开为,这样就可在单个管子中处理多个样品。流体靠泵通过管子。将这些特性引入一个系统中,其中该系统可自动清洗管子、移动携带有含样品孔的样品架并将管子与样品架的孔相接触。
第5,785,926号美国专利公开了一个运输小体积样品的系统。在该系统中,至少有一个毛细管用于运输小体积的样品。精确度线性调节器作为气动活塞使用管子来等分并分配液体,该调节器与计算机控制的马达相连。用光学传感器检测毛细管各段中液体的存在,从而监测样品的量。该系统包括含需储存液体的流体工作站,及安置该运输毛细管的安置设备。
第5,897,842号美国专利公开了利用热循环来实现自动化样品制备的系统。在该系统中,将反应混合物泵入毛细管中。该管的一端用来自相关泵的压力封闭,而另一端则通过将该管顶住屏障而得以封闭。该泵也用于将流体移入管中。一旦管的两端封闭后,将其暴露于热循环中。在此系统中,机器人传输装置将管子在样品制备工作站和热循环工作站之间移动,泵在样品制备工作站将反应混合物的组分加到管子中。
在上述所讨论的系统中,需要先将诸如DNA模板之类的样品与试剂混合在一起,然后才将混合物引入反应室中。此中间混合步骤不可避免地需要额外的试剂和样品处理步骤,从而产生了浪费。例如,如果用分开的微量移液器将样品和试剂分配到混合室中,各移液器中将残留有小量的样品和试剂,而混合室中也会有反应混合物残留。在高通量系统中,这种浪费的成本及提供新的或已适当清洗的移液管及混合室会迅速上升。经常需要分配相对大量、含低
浓度反应组分的液体,以补偿分配小量、高浓度反应组分所带来的不准确度,从而使浪费的程度更加严重。通常,形成反应混合物后,只需要一部分用于分析,剩下的就丢弃了。
因此,需要有种方法,不必先将样品与发生反应所需的试剂混合,就将需分析的生物样品引入反应室中。
第5,846,727号美国专利公开了亲和捕获的方法,在该方法中,模板DNA固定在玻璃毛细管的内部,该管用作热循环的反应室。首先将生物素分子固定到该管的内表面,然后装满与该生物素紧密结合的抗生物素蛋白或链霉抗生素蛋白,将毛细管制备好。要测序的模板DNA通过PCR与生物素部分共价结合,然后暴露于毛细管内部的抗生物素蛋白中。这样就通过生物素-抗生物素蛋白-生物素连接将模板固定到毛细管的管壁上。洗去未结合的模板之后,加入测序试剂,毛细管的内容物进行热循环以激活测序反应。以这种方式,模板DNA上样到毛细管之前不必与测序试剂混合。
然而,前面刚刚所述的方法需要用PCR将生物素与模板DNA连接,需要在测序反应之前制备好,和需要进行一次反应。该必要的预步骤增加了与获得序列数据相关的时间和成本。而且,该DNA的固定实际上是不可逆的,因为生物素-抗生物素蛋白的连接强度很强,以至于只有使用变性该抗生物素蛋白的试剂才能打开此连接,而这一处理也会使反应中的其它蛋白质组分变性。结果模板
DNA必须保持固定于毛细管的内表面。因为DNA在溶液中不是游离的,就得需要额外的时间才能使反应组分扩散到可与DNA相互作用的管壁。另外,当需要回收毛细管时,就得将抗生物素蛋白变性、洗掉以除去模板DNA,然后重新在毛细管负荷抗生物素蛋白,所有这些均会增加时间及试剂成本。
因此,本领域内一直需要有一种方法,可以将分子引入反应室中而不需要起始的样品-试剂混合步骤,也不需要将亲合捕获物部分附到样品中所有分子上,并且其中模板固定是可逆的。这样,可以使成本降到最低、处理速度最快。
毛细管阵列电泳系统及毛细管电泳微芯片分析系统可以检测亚阿摩尔的DNA测序反应产物。与板状凝胶相比,其对测序反应中模板DNA理想含量的偏差的容许程度下降,它的超常灵敏度正是以此为代价换来的。例如,如果测序反应中的模板DNA太少,则荧光标记引物的延伸产物量收率将很少。这就导致用激光扫描反应产物时信号强度极弱。这样就使分析色谱的软件无法充分实施光谱分离,造成序列阅读长度比平均长度短,反应得重复,否则序列信息就会丢失。
模板DNA的过量也会因毛细管超负荷而产生问题。尽管荧光标记反应产物的产率足够高,如果模板过量,它将在动电注射时与测序产物竞争进入毛细管。大量模板DNA的存在可使毛细管的总流量下降,或使流量突然下降,可以各种形式表现出来。超负荷可导致信号强度弱,层析谱中可解释的荧光强度峰出现得晚,反应
产物分辨率极低,因为荧光激发广而弥散。所有这些效应均会导致阅读长度变短和测序数据质量下降。
超负荷的问题一般是通过稀释测序反应或仔细滴定引入测序反应的模板DNA量来解决。尽管理论上这些解决方案都不复杂,但是前者需要重复反应的分析,后者则用传统的方法在高通量系统中难以实现。这些方法包括检测与样品中DNA结合的荧光染料量,并与标准浓度曲线比较;或于260nm波长处测定紫外吸收,可将其转化成DNA浓度的绝对测量值。因此,本领域内一直需要方法来滴定将要用高通量毛细管电泳分析系统分析的测序反应模板DNA量,其中使成本最低化和速度最快化是关键的。
另外还需要有一套自动化系统,可以高度平行的方式进行小规模热循环反应。该系统应该可以允许快速制备循环反应,同时最低限度地耗费试剂。将减少反应所需试剂和减少反应所需时间结合起来,将可极大地减少制备循环反应的总体成本。
至于蛋白质组学,分析蛋白组需要分离、定量和鉴定很大的蛋白质集合。
典型地,可以将不同的技术联用来完成这样的分析,如先进行2维电泳分离,然后进行酶消化并用基质辅助激光解吸/