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专利名称::用于***基化合物的立体选择还原的氧化还原酶的制作方法用于***基化合物的立体选择还原的氧化还原酶本发明涉及用于通过对映体选择性酶促还原将***基化合物转化成相应的手性羟基化合物的方法,其中所述***基化合物用氧化还原酶还4奪性还原的新的氧化还原酶。光学活性化合物是对于药学活性化合物、芳香物质、信息素、农业药品和酶抑制物的合成具有广泛应用性的有价值的手性子(chiron)。因而,手性化合物以及手性合成技术的提高的需求是在药物工业中特别受注意的,因为在将来,外消旋化合物难以用作药物制品。原手性***基化合物的不对称还原是立体选择性催化的一部分,其中生物催化构成了对化学催化的强有力的竟争技术。化学的不对称氢化作用需要使用高度毒性和环境有害的重金属催化剂,使用极端的因而耗能的反应条件以及大量的有机溶剂。此外,这些方法通常特征是副反应和不充分的只于映体过量(enantiomericexcesse)。在自然中,原手性***基化合物向羟基化合物的还原和相反的过程在许多生物化学途径中发生,在初级新陈代谢和在次级新陈代谢中,在每个器官中,并且被不同种类的仲醇脱氢酶和氧化还原酶催化。通常地,这些酶是辅因子依赖性的。基础可能性过:i模型系:的基础i被反复展现,'、其中分离的氧化还原酶和各种全细胞生物转化系统被用于该任务。从而,对于适度的反应条件、没有副产物和通常显著更可实现的对映体过量,生物催化方法成为非常有利的。对于可实现的对映体过量、降解产物和副产物的形成、以及对于产物分离,相对于涉及全细胞的方法,使用分离的酶是有益的。此外,使用全细胞处理不可能用于每一个化学公司,因为为此需要特定设备和知识。近来,可能展现的是,在具有有机溶剂的水性
/有机两相系统中使用分离的氧化还原酶是极度有效的、经济的以及在高浓度(>5%)也是可行的。在所描述的系统中,通常在水中难溶的要还原的***基化合物从而形成与有机溶剂在一起的有机相。并且,有机溶剂本身可能部分地被一起分配。在这种情况下,有机相从要还原的***基化合物形成(DE10119274、、、)。辅酶再生因而通过仲醇的同时发生的氧还而实现,为此,在大多数情况下,使用便宜的水可混合的2-丙醇。高对映体选择性的适合的R-和S-特异性氧化还原酶和脱氪酶的实例有来自Cam/Wa;Mra戶"ows的羰基还原酶(CPCR)(US5,523,223和US5,763,236(;15(11):950-8"和来自尸,c/zz^c"/ww/"to()的羰基还原酶。来自红串红球菌(i^ot/ococc^eo^ro尸o/^)的羰基还原酶(RECR)(US5,523,223)、来自jVo/raWa/ksc(3(.,63(10)(1999)
,-1729)、(;62(4):380-)和赤红球菌(脇c/ococ,(;68(2):402-6)的羰基还原酶。来自享L^干菌属(Z^"c^a"〃w力(Lactobacilluskefir(US5200335)、Lactobacillusbrevis(DE19610984Al)(;56Pt12:1696-8)、Lactobacillusminor(DE10119274)或假单胞菌属(尸化w允mo憩力(US05385833)(;59(4-5):483-.,,57,1532)的R-特异性仲醇脱氬酶。然而,迄今已知的酶还不足够用于开发***基化合物的立体选择性还原的完整市场潜力。一个方面,这可以由工业酶对于底物谱、最适pH值以及温度和溶剂稳定性具有非常不同的性质的事实来解释,所述性质通常是相互补充的。因而,甚至相对类似的同源酶可能对于一种特定的底物展现完全不同的转化行为。另一方面,不是几乎所有的所描述的酶都被克隆和可过量表达到足够的数量,这意味着这些酶对以工业使用是不可获得的。为了尽可能广泛地发挥酶学不对称氢化作用的合成潜力,因而必需的是拥有一包尽可能地广泛的、不同的工业可接受的氧化还原酶,所述氧化还原酶进一步适合于在具有有机溶剂的水性
/有才几两相系统中使用。现在本发明的主题是多种新的、对映体选择性R-和S-特异性氧化还原酶,特征在于在水性/有机两相系统中良好的稳定性以及在大肠杆菌Escherichiacoli中良好的表达能力(>500单位/),以及程:5土。、'、'土、、'-'、、、根据本发明的氧化还原酶的特征在于它们具有氨基酸序列,在所述氨基序列中(a)至少70%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8之一的氨基酸,或(b)至少55%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸,或(c)至少65。/。的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:3的氨基酸,或(d)至少75%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:4的氨基酸,或(e)至少65%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:5的氨基酸,或(f)至少50%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:7的氨基酸,或(g)至少72%的氨基酸相同于氨基酸序列SEQIDNO:129的氨基酸。根据SEQIDNO:1的多肽可以从酵母、特别是从红酵母属(Rhodotorula)的酵母、特别是从粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:9,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:l的蛋白。来自粘质红酵母的氧化还原酶促还原,例如,2-辛***为S-2-辛醇,并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。来自粘质红酵母的氧化还原酶是,例如,具有SDS-凝胶中测定的分子量30土2kDa的同型二聚体。所述氧化还原酶的还原反应的最佳
,-10的范围内。来自粘质红酵母的氧化还原酶展现了良好的温度和pH值稳定性,。C的温度下、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。此外,来自粘质红酵母的氧化还原酶展现了有机溶剂中的高稳定性。根据SEQIDNO:2或SEQIDNO:8的多肽可以从酵母、特别是,人毕赤酵母属CP/'c/n'")、念珠菌属(C""c^/")、尸"c/z;Ayo/e"、DeZ"rom少ces或/M""c/7e"/h'a属的酵母、特别是从粉状毕赤酵母(尸Zc/n"/"n"we)DSMZ3316或CandidanemodendraDSMZ70647获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:10和核酸序列SEQIDNO:16,其分别编码氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:8。所述氧化还原酶优选地还原2-丁***成R-2-丁醇,并优选地氧化2-丁醇的两种对映体中的R-2-丁醇。来自粉状毕赤酵母(尸,c/n'a/an"ora)的氧化还原酶展现了与针对R-2-辛醇相比显著更高的针对R-2-丁醇和2-丙醇的活性,此外,该酶展现了与针对2-辛***相比显著更高的针对***和2-丁***的活性。然而,来自Candidanemodendra的氧化还原酶展现了针对R-2-丁醇、2-丙醇和R-2-辛醇的相似的活性,此外,该酶还展现了针对2-辛***的大约相似的活性。来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2kDa
的同型二聚体。,-10的范围内。来自粉状毕赤酵母的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性,、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。来自Candidanemodendra的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2kDa的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值是pH6,氧化反应的最佳pH值范围从10到11。来自Candidanemodendra的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性,、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的多肽可以从酵母、特别是从毕赤酵母属和念珠菌属的酵母、特别是从树干毕赤酵母(Pichiastipitis)DSMZ3651和PichiatrehalophilaDSMZ70391获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:11和核酸序列SEQIDNO:15,其分别编码SEQIDNO:3和SEQIDNO:7的多肽。来自毕赤酵母属和念珠菌属的酵母的羰基还原酶,其具有与氨基酸序列SEQIDNO:3的至少65°/。同一性,或与氨基酸序列SEQIDNO:7的至少50%同一性,优选地还原2-辛***成S-2-辛***,并优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它们还特别适合于4-卣代乙酰乙酸酯还原成R-4-囟代-3-羟基丁酸酯。来自树干毕赤酵母的氧化还原酶是具有SDS-
凝胶中测定的分子量36±2kDa的同型二聚体。,-。来自树干毕赤酵母的氧化还原酶展现了良好的pH值和溶剂稳定性,、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。来自Pichiatrehal叩hila的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量36±2kDa的homomer。所述氧化还原酶的还原反应的最佳pH值范围是7-,氧化反应的最佳pH值范围是7-8。根据SEQIDNO:4的多肽可以从明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌、特别是从***明串珠菌(Leuconostoccar簡um)DSMZ5576获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:12,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:4的蛋白。所述多肽特别适合于2-辛***向R-2-辛醇的还原,以及适合于R-2-辛醇的氧化。它还非常适合于4-卣代乙酰乙酸酯向S-4-囟代-3-羟基丁酸酯的还原。来自***明串珠菌的氧化还原酶是具有SDS-凝胶中测定的分子量27±2kDa的同型二聚体。,-。来自***明串珠菌的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性,。C的温度下、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:5的多肽可以从放线细菌
(Actinobactena)纲的细菌、特别是从微杆菌属(Microbacterium)的细菌、特别是从微杆菌属细菌DSMZ20028获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:13,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:5的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛***向S-2-辛醇的还原,并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卤代乙酰乙酸酯向R-4-卤代-3-羟基丁酸酯的还原。来自微杆菌属细菌DSMZ20028的氧化还原酶是,例如,具有SDS-凝胶中测定的分子量35±2kDa的同型四聚体。,-。来自微杆菌属细菌的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性,(TC的温度下、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:6的多肽可以从放线细菌(Actinobacteria)纲的细菌、特别是从戈登氏菌属(Gordona)的细菌、特别是从深红戈登氏菌(Gordonarubripertincta)DSMZ43570获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:14,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:6的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛***向S-2-辛醇的还原,并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卣代乙酰乙酸酯向R-4-卣代-3-羟基丁酸酯的还原。来自深红戈登氏菌DSMZ43570的氧化还原酶是具有
SDS-凝胶中测定的分子量41±3kDa的homomer。,。来自深红戈登氏菌DSMZ43570的氧化还原酶展现了良好的温度、pH值和溶剂稳定性,-10的pH值范围中以及在最高达55。C的温度下、甚至数小时的孵育时间,仅显示了微小的活性损失。根据SEQIDNO:129的多肽可以从酵母、特别是从路德酵母属(Lodderomyces)、4+另'J是乂人LodderomyceselongisporusDSMZ70320获得。本发明的进一步的主题是核酸序列SEQIDNO:130,其编码具有氨基酸序列SEQIDNO:129的蛋白。所述多肽非常适合于2-辛***向S-2-辛醇的还原,并且优选地氧化2-辛醇的两种对映体中的S-2-辛醇。它还非常适合于4-卣代乙酰乙酸酯向R-4-囟代-3-羟基丁酸酯的还原。此外,本发明涉及融合蛋白,其特征在于它们代表具有氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129的氧化还原酶或其同源物,其在N-末端或羧基末端肽键地连接到进一步的多肽。融合蛋白可以,例如,更容易地从其他蛋白分离,或可以以更大的数量重组表达。此外,本发明涉及抗体,所述抗体特异性地结合根据SEQIDNO.-1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:129
的氧化还原酶或结合其同源物。这些抗体的产生根据已知的方法通过免疫适合的动物和随后回收抗体来进行。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的。氨基酸序列的比较可以,例如,在互联网上在蛋白质数据库例如SWISS-PROT、PIR以及在DNA数据库例如EMBL、GeneBank等等中使用FASTA程序或BLAST程序进行。在这样做时,通过BLAST算法(BasicLocalAlignementSearchTool)(幽c'/m/"/,,/.Jcc/.,"(5dS)的方式确定最佳比对。作为基础,使用PAM30矩阵作为评估序列相似性的计分矩阵。(Da>^o#/Sc/zvrac兄M,Ocw",./97&,5广3>Z)aj^of广edJ345-352,iV""owa/S/omed/ca/Ae化0Tc//owtableseeoriginaldocumentpage23在根据实施例1(分批活性筛选)的测试系统中测定氧化还原酶的酶活性,蛋白质数量的测定根据Lowryetal.,JournalofBiologicalChemistry,193(1951):265-275或Petersonetal.,AnalyticalBiochemicstry,100(1979):201-220)进行。酶活性比蛋白质数量的商产生比活性,其中1pmol每分钟的转化相应于1单位(U)。4《凝^霧4AStUZ的^谢^真必还^箱的^^对于蛋白质分离,在离心后获得的来自A^'cra^"en'ww2W2S的溶胞产物直接施加到用50mM磷酸钾緩沖液pH=-SepharoseFF柱上,用提高的线性盐梯度洗脱。从而,