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用于通过同源重组转化和选择酵母转化体的盒和方法
本发明涉及用于选择具有通过同源重组整合的目的核酸片段的转化酵母细胞的方法,所述方法包括以下步骤:(i)使酵母细胞与以下物质相接触:包含正选择基因和含夹有限制性位点之51和31重组区的同源重组位点的载体,以及待通过同源重组插入所述载体的同源重组位点中的目的核酸片段,所述核酸片段的侧翼是与同源重组位点的51和31重组区基本相同的区域;以及(ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞;(iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞,所述酵母细胞的特征在于:负选择基因也存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制,所述启动子与负选择基因在目的DN***段插入之前在所述载体中可操作地连接;以及25(iv)所述方法还包括使用所述负选择基因选择含有所述目的DN***段的酵母细胞的步骤。本发明还提供了用于实施本发明方法的盒和试剂盒。
【专利说明】用于通过同源重组转化和选择酵母转化体的盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于容易地选择通过同源重组得到的期望转化酵母细胞的盒(cassette)和方法。
【背景技术】
[0002]酵母细胞特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是生产重组蛋白的重要生物体,原因是它们在化合物如工业用酶的情况下满足进行有效大量生产的需求以及在药用蛋白质情况下满足安全性和可靠性标准二者。已对酿酒酵母进行了广泛研究,因此对其进行操作的分子和遗传工具是可用的并且其是成功的工业微生物。
[0003]使用不同技术来通过表达载体将目的DN***段插入酵母细胞中。第一种方法是公知的通过DNA修饰酶(DNA限制酶和DNA连接酶)进行的DNA亚克隆。简言之,为了将DN***段亚克隆到穿梭载体中,在启动子的3’端一般存在多克隆位点(MCS)。该MCSDNA包含核酸内切酶(称为限制酶)所识别的在基因组中很罕见的核苷酸序列。在用存在于底物两者中的特定限制酶通过典型分子方法对DNA(待亚克隆的DNA和穿梭载体)两者进行酶消化(:ALaboratoryManual,2001,第3版,CSHLPress)之后,进行连接并在用连接产物进行细菌转化之后在细菌中得到质粒的增殖。为了选择携带有期望质粒的细菌转化体,通过分析多个个体转化体的质粒含量(通过PCR或通过限制酶)进行最后一步。在选择了携带有期望质粒的单个细菌转化体后,就使用传统技术进行质粒生产、提取和纯化。使用几百纳克的该纯化质粒来转化酵母。
[0004]用于将DNA亚克隆到穿梭酵母载体中的一种更简单的方法利用在酵母中发生的同源重组事件。在该情况下,不需要使用细菌作为用于质粒增殖的宿主,原因是在一步酵母共转化(经单切的去磷酸化载体和PCR扩增DNA)中使用了在两侧均携带有与位于表达载体中之序列同源的序列的PCR扩增DN***段。
[0005]但是,同源重组不允许得到100%的期望转化体:通过该方法得到的酵母转化体携带有空载体(当同源重组不发生时)或期望质粒。本发明人示出全部转化体的约仅70%含有期望质粒。为了在所有酵母转化体中选出目的酵母转化体,必须对几个单一的酵母转化体进行几个步骤,其由酵母DNA纯化和分析或酵母功能测定组成。
[0006]因此,需要用于容易地选择通过同源重组得到的目的酵母转化体的新工具和方法。
【发明内容】
[0007]本发明人开发了用于容易地选择通过同源重组在表达载体中整合有目的核酸片段的转化酵母细胞的新方法和盒。所述方法和盒使得能够节约金钱和时间:因此,它们避免了用以选择期望酵母的DNA纯化步骤,并且它们允许在一步中选择期望的转化酵母细胞。
[0008]本发明涉及用于选择具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段的转化酵母细胞的方法,所述方法包括以下步骤
:[0009](i)使酵母细胞与以下物质相接触:
[0010]-包含以下的载体:
[0011]〇正选择基因,
[0012]〇包含夹有(framing)限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点,和
[0013]-待通过同源重组插入所述载体的同源重组位点中的目的核酸片段,所述核酸片段的侧翼是与同源重组位点的5’和3’重组区基本相同的区域;以及
[0014](ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞;
[0015](iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞,
[0016]其特征在于:
[0017]-负选择基因也存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制,所述启动子与负选择基因在目的DN***段插入之前在所述载体中可操作地连接;以及
[0018](iv)所述方法还包括使用负选择基因选择含有目的DN***段的酵母细胞的步骤。[0019]本发明还提供了包含以下部分的盒:
[0020]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点,以及
[0021]-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因;
[0022]以及包含以下部分的载体:
[0023]-复制起点,
[0024]-正选择基因,所述正选择受启动子控制,
[0025]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点,以及
[0026]-负选择基因,其存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制,所述启动子与负选择基因在目的DN***段插入之前在所述载体中可操作地连接并且受终止子控制。
[0027]本发明还涉及用于得到本发明载体的方法,所述方法包括将根据本发明的盒整合到载体(优选质粒)中的步骤,所述载体(优选质粒)包含:
[0028]-正选择基因,和
[0029]-启动子,
[0030]从而使位于盒之所述同源重组位点下游的所述负选择基因受载体中所存在的所述启动子控制,所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
[0031]本发明最后提供了包含以下部分的试剂盒:
[0032]-根据本发明的盒,和
[0033]-至少一种酵母细胞培养基。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]附图构成本说明书的一部分,其包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参照这些附图的一幅或更多幅,并与本文所示的具体实施方案的详细描述相结合,可更好地理解本发明。
[0035]图1:产生可插入pRS316表达载体的启动子区下游的盒。
[0036]该构建的目的是产生盒,其中ura30RF将处于任意穿梭酵母载体his3,Leu2或Trpl形式的启动子控制之下。如图1a所示,ura3的前面是5’同源区(RH5)、独特限制性位点和3,同源区(RH3)。
[0037]启动子与ura30RF起始密码子之间的距离在该结构中应导致ura3表达,而如果由于DN***段在RH5与RH3序列之间插入使得ura3基因距启动子很远,则ura3将不表达。
[0038]然后,将转化体与5-F0A—起孵育将导致表达URA3的转化体死亡,而导致含有在其中插入PCR扩增片段之载体的转化体生长(图1b)。
[0039]图2:通过5-F0A孵育选择含有HIV-1蛋白酶的酵母重组体。
[0040]用XhoI切割vs3gal-RH,纯化,与HIV-蛋白酶的PCR扩增序列(在其5’和3’末端存在RH1-5’和RH1-3’序列)混合并用于转化W303酵母菌株。使转化体在缺少组氨酸和
5-F0A的基本培养基(minimalmedia)中在30°C下生长24小时至最终浓度为Img/ml,然后在缺少组氨酸的基本培养基中保持48小时。用无菌水将细胞清洗3次,测试HIV-1蛋白酶在含半乳糖培养基中的表达。酵母中HIV-1蛋白酶的表达导致细胞死亡(Blanco等,2003,专利申请W02011/007244)。结果清楚地证明,所产生的DNA盒对于通过5-F0A孵育仅仅选择其中DN***段被插入载体中的克隆是实际有效的,所述克隆如通过在半乳糖(SGalR-his培养基)中细胞生长的停滞所示,该停滞通过添加HIV-1蛋白酶的特定抑制剂(IP)来阻止。[0041]发明详述
[0042]本发明的方法
[0043]本发明的第一个目的涉及用于选择具有通过同源重组整合于载体中的目的核酸片段的转化酵母细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
[0044](i)使酵母细胞与以下物质相接触:
[0045]-包含以下的载体:
[0046]〇正选择基因、
[0047]〇包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点,和
[0048]-待通过同源重组插入所述载体的同源重组位点中的目的核酸片段,所述核酸片段的侧翼是与同源重组位点的5’和3’重组区基本相同的区域;以及
[0049](ii)用所述载体和所述目的核酸片段转化所述酵母细胞;
[0050](iii)选择含有带所述正选择基因之所述载体的酵母细胞,
[0051]其特征在于:
[0052]-负选择基因也存在于载体中同源重组位点的下游并且受位于所述同源重组位点上游的启动子控制,所述启动子与负选择基因在目的DN***段插入之前在所述载体中可操作地连接;以及
[0053](iv)所述方法还包括使用负选择基因选择含有目的DN***段的酵母细胞的步骤。
[0054]应注意,通过本发明的方法:
[0055].因为低与所述启动子可操作地连接的负选择基通的表达,所以在载体中未整合有目的DN***段的转化酵母细胞在步骤(iv)中死亡,并且
[0056].因为当目的核酸片段插入所述负选择基因与其启动子之间时不再与所述启动子可操作地连接的负选择基因不表达,所以在载体中整合有目的DN***段的轾化酵母细胞在步骤(iv)之后存活。[0057]术语“转化”是指使DN***段、质粒或载体转移到宿主生物体中。包含这样的DN***段、质粒或载体的宿主生物体称为“重组”或“转化”生物体。
[0058]在本发明的方法中,转化生物体是酵母,例如酿酒酵母、白假丝酵母
(Candidaalbicans)和麦芽糖假丝酵母()、多形汉逊酵母(HansenulapoIymorpha)>脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳酸克鲁维酵母()、季氏毕赤酵母(Pichiaguillerimondii)和巴斯德毕赤酵母()、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和解脂耶氏酵母(YarrowiaIipolytica)。优选地,转化酵母细胞是酿酒酵母。
[0059]术语“载体”或“质粒”是指常携带有不是细胞中心代谢之一部分的基因并且通常是环状双链DNA分子形式的染色体外元件。这样的元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的线状或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬茵体或核苷酸序列,其中大量核苷酸序列被连接或重组成独特的构建体,其能够将用于所选基因产物的启动子序列和DNA序列与适当的3’未翻译序列一起引入细胞中。
[0060]因此本发明的载体和质粒包含在酵母中有功能的复制起点。术语“在酵母中有功能的复制起点”是指允许载体或质粒独立于染色体复制的任意核酸序列。一般来说,复制起点在以下酵母的至少一种或更多种中有功能:酵母酵母、白假丝酵母(Candidaalbicans)和麦芽糖假丝酵母()、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳酸克鲁维酵母()、季氏毕赤酵母(Pichiaguillerimondii)和巴斯德毕赤酵母
()、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。合适的复制起点包括例如arsl、着丝点ori和2μori。[0061]在一个实施方案中,本发明的方法包括通过将盒整合到包含:
[0062]-正选择基因,和
[0063]-启动子,
[0064]的载体(优选质粒)中从而得到本发明载体的早先步骤,所述盒包含:
[0065]-包含夹有限制性位点的5’和3’重组区的同源重组位点,和
[0066]-存在于所述同源重组位点下游的负选择基因,
[0067]从而使位于盒的所述同源重组位点下游的所述负选择基因受载体中存在于盒之所述同源重组位点上游的所述启动子控制,所述启动子与所述负选择基因在所得载体中可操作地连接。
[0068]根据本发明,术语“盒(cassette)”应认为是包含通过任意方式(例如,通过酶消化和DNA连接、通过重组,更特别地通过同源重组)整合到质粒中的特定核酸序列的元件。
[0069]本文所使用的术语“启动子”是指能够引导与所述启动子可操作地连接的基因或编码序列转录(因此表达)的DNA