文档介绍：该【荧光定量PCR技术-讲座0515 】是由【落意心冢】上传分享，文档一共【49】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【荧光定量PCR技术-讲座0515 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。荧光定量PCR技术-讲座0515
基本原理
themegallery
Companyname
基本原理
themegallery
Companyname
Real-timeqPCR的定量原理
2
Real-timeqPCR的检测方法
3
Real-timeqPCR的基本概念
1
Real-timeqPCR的解析方法
4
Real-timeqPCR的计算方法
5
Real-timeqPCR的定义
themegallery
Companyname
实时荧光定量PCR技术:
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。
Real-timePCR仪
ABI7500
PCR:基本原理
Denaturation:
94–96°C
Annealing:
50–65°C
Extension:
70–75°C
基本要素:
Template
Primers
DNApolymerase
dNTP,N=A,G,CorT
themegallery
Companyname
与普通PCR的比较
S形曲线,具有平台效应
终点检测法
反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能
不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量
定量原理
themegallery
Companyname
理想的PCR反应:
X=X0*2n
实际的PCR反应:
X=X0(1+Ex)n
n:扩增反应的循环次数
X:第n次循环后的产物量
X0:初始模板量
Ex:扩增效率
定量原理
在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)
XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.
在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M
方程式(1)两边同时取对数得:
logM=logX0(1+Ex)Ct(2)
整理方程式(2)得:
logX0=-log(1+Ex)Ct+logM(3)
log(1+Ex)Ct=-logX0+logM
Ct=-klogX0+b
themegallery
Companyname
themegallery
Companyname
每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。
确定初始模板的浓度
定量原理
Ct=-klogX0+b
themegallery
Companyname
Ct值的特点:
相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定;
Ct值则极具重现性