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专利名称:用于超灵敏的核酸检测的电传感器的制作方法
技术领域:
本发明涉及电化学领域。更为具体地,本发明涉及利用电化学设备和方法对核酸的检测。
背景技术:
随着例如DNA和RNA等核酸的出现,近10年见证了微阵列在基因表达谱和单核苷酸多态性(SNP)检测中所经历的变更。例如结合了聚合酶链反应(PCR)的微阵列技术,由于其巨大的并行性和高的输出量,已经成为当前的技术水平。尽管分子生物和医药的发展表现出相当的前景,但基于荧光的微阵列技术在光学检测中存在一些固有的缺点,这包括需要昂贵而庞大的光学扫描仪、由于荧光染料的光致退色导致的潜在图像恶化和由于标记荧光染料之间的光谱串扰而导致的模糊的读出。核酸微阵列的电模拟可为核酸的快速定量化提供一个可行的选择,这对于临床以及防护应用场合尤其是期望的。在过去几年内,研究者已经提出了具有直接电转换的几个作标记和无标记的感测技术。直接电转换相对其它方法具有几个优点。最好的前景之一是使用标准的CMOS技术可以使传感器单元与关联的信号处理电路进行片上集成的可行性。参考文献,相比于电阻或电容器件,利用各种微米和纳米制备技术已经对场效应器件进行了更为广泛的研究。在前一类器件中,经过在栅介质上的与生物有关的相互作用,一旦引入带电分子
(例如核酸),通过表面电势的变化来调节电特性。场效应感测避免了电流通过DNA传导,该导电可能产生不想要的电化学变化。然而,限制场效应传感器用于DNA检测的最关键参数为(i)很小的信号背景比和(ii)狭窄的检测窗口。另外,信号的可靠性经常出现问题,这是因为直流读出电子电路在栅极输入处经常出现长期的漂移。最近,Shiigi,H.、Tokonami,(2005,,,)构建了金纳米颗粒(GNP)的膜,使用癸二硫醇作为钼微电极之间的隔离物。在他们的方法中,在用于桥接相邻GNP的受体-靶分子复合物的形成之前和之后,作者监测了电荷载流子的隧道效应。由于电荷载流子通过DNA分子的流动相当有限,因此在杂交时基线电流的变化小于1%,使得该方法倾向于产生错误的信号。在另一方法中,Roy,S.、Vedala,(2008,NanoLett,,,)开发了一种夹于一对碳纳米管电极之间的单链DNA(ss-DNA),从而用探针探查ss_DNA的自有电荷导电性以及其杂交后的双键结构。由于在碳纳米管电极和捕获探针之间存在非常短的化学接头,信噪比被提高到25%。虽然对电荷流机制的基本认识感兴趣,但来自这样的单个纳米管单DNA系统的信号的可靠性可能不够高,从而不足以在生物医药界被接受。而且,经济有效地制备高度一致的具有高扩展潜力的纳米结构对于很多技术应用非常重要,然而其仍为技术挑战。很多自底向上
(bottom-up)的方法遇到了某些限制,例如器件之间的一致性,这反映出器件在制备过程中的差异,还遇到低产量以及低可扩展性。另一方面,广泛应用的制备窄纳米间隙的自顶向下(top-down)的方法,例如机械裂结法、电子束刻蚀法、电迁移、蘸水笔刻蚀、透射电子显微镜辅助纳米溅射以及电镀,都必须解决例如高成本、低产量等问题,目的是离常规制备方法更近一步。因此,本发明的一个目标是提供新颖的、适于克服至少一部分上述缺点的设备和方法。
发明内容
在第一方面,本发明涉及一种用于检测核酸分子的传感器。该传感器包括或由下列部件组成电极结构,其包括第一电极、第二电极以及重叠区,其中,在所述重叠区内所述第二电极的一部分与所述第一电极的一部分重叠,以使所述第二电极的顶面水平高于所述第一电极的顶面水平,在所述第一电极和所述第二电极之间设有绝缘层,该绝缘层与所述第一电极和所述第二电极接触;第一核酸探针,其固定于所述第一电极的表面;和第二核酸探针,其固定于所述第二电极的表面。在另一方面,本发明涉及一种核酸检测成套装置,该成套装置包括或由下列部件组成如本文所述的传感器;含有金属前驱体的溶液;和适用于对所述金属前驱体进行化学还原的溶液。在又一方面,本发明涉及一种制造本发明的传感器的方法。该方法包括或由下列步骤组成提供本文所述的电极结构;在第一电极和第二电极的表面固定第一核酸探针;
通过第一电极或第二电极的电位扫描,将第一核酸探针从所述第一电极或所述第二电极的表面剥离;以及在所述第一核酸探针未被剥离掉的电极的表面固定第二核酸探针。在又一方面,本发明涉及一种用于检测靶核酸的方法。该方法包括或由下列步骤组成提供如权利要求1四中任一项所述的传感器,其中所述传感器包括两个电极,而且将核酸序列固定在与靶核酸序列互补的电极的表面;在第一步利用疑似包含靶核酸的样本液体孵育所述传感器;使所述传感器的核酸分子金属化;以及进行电导测量以判断所述靶核酸是否存在。
结合非限制性的示例和附图并参照具体说明,将更好地理解本发明,在附图中图1图IB表示阶梯式电极结构,其中顶电极⑴部分地与底电极(2)重叠从而形成阶梯式结构。该阶梯式结构的较高的台阶是由在重叠区4(条纹区域)与底电极(2)重叠的顶电极(1)的顶面形成。该阶梯式结构的较低的台阶由底电极O)的顶面形成。在图I(B)所示的实施例中,台阶之间的边缘由三个侧壁(1',1〃,1"‘)形成,这三个侧壁构成顶电极(1)和布置于底电极和顶电极之间的绝缘层(3)的一部分。在图2(G)中,台阶的侧壁以附图标记200来表示。图I(A)表示其中顶电极与底电极完全重叠的阶梯式电极结构。该阶梯式电极结构的边缘是由顶电极和布置于底电极和顶电极之间的绝缘层的两个侧壁
(1',1")形成。图I(C)表示能用于传感器阵列中的阶梯式电极结构。顶电极压在底电极上,从而在顶电极和底电极重叠的区域中形成台阶。与在图I(A)中一样,图I(C)所示的阶梯式电极结构的边缘也是由顶电极和布置于底电极和顶电极之间的绝缘层的两个侧壁形成。图IDIF表示其中第一核酸探针和第二核酸探针分别固定于第一电极和第二电极的电极结构。出于示例性的目的,仅表示了在电极表面固定一个核酸探针,但实际上,在电极表面上固定有多个核酸探针。可直接地或通过接头(在图ID图IF中位于核酸探针和电极表面之间的圆形端)将核酸探针固定至电极表面。图2和图3图示用于制造根据本发明的实施例的传感器的方法。将硅片基板120的上层Iio氧化(SiA层110)。在第一步骤(图3A)中,基板层120的上层110涂有光刻胶层100。在图:3B和2(步骤1)中,表示了在第二步骤中如何使光刻胶层图形化和显影以限定出第一电极的空间。在第三步骤(图3C)中,沉积用于形成第一电极的材料130。也可首先沉积粘合层,之后沉积用于形成第一电极的材料。在第四步骤(图3D)中,去除光刻胶层100和覆盖光刻胶层的所有电极材料以形成第一电极130(图2,步骤2、。在第五步骤中,在之前所形成的层的上方沉积绝缘层140以覆盖第一电极130和基板层110(图3E和图2中步骤幻。在进一步的步骤中,通过涂敷另一光刻胶层
160而使用于第二电极的空间图形化(图2中步骤4)。在沉积用于形成第二电极150的材料和任意可选的粘合层之后,去除光刻胶层160,从而得到在图2的步骤5中(也参见图3F)图示的器件。在最后的步骤中,去除绝缘层140的未被用于形成第二电极150的材料覆盖的部分,剩下图2中步骤6以及图3G图示的电极结构。该方法得到一种阶梯式电极结构,其具有形成于第一电极130的顶面与第二电极150的顶面之间的台阶的侧壁200。侧壁200是由第二电极150和绝缘层110形成。图4图示在整个硅片120的上方所沉积的二氧化硅薄膜的椭圆偏振研究的结果。图5表示二氧化硅基板层和金电极层的AFM图像。()。该图像表示包括由铬制成的粘合层的第一电极,其中粘合层与基板SiO2层和第一电极的金层直接接触。。。图7表示绝缘体(SiO2)/底电极(Au)界面的原子力显微镜(AFM)图像。图8(A)表示传感器器件的示意图示。(A)5-20nm厚的绝缘层140夹于一对Au微电极130、150之间。通过改变绝缘层的厚度可容易地调节绝缘层140的宽度(纳隙)。(B)感测过程(I)跨越形成于顶电极150与底电极130之间的台阶的两个不同的核酸捕获探针(在图8(B)中的波浪线)的固定化;(II)与靶DNA的杂交(在上核酸探针和下核酸探针之间连接的波浪线
);(III)沿桥接分子的骨架形成银线,从而导致在电极对之间导电路径的形成。图9表示典型的传感器阵列芯片(尺寸IOmmXIOmm)的立体显微图像。图10表示在由绝缘层隔开的两个电极上对两个不同捕获探针的固定化(A)清洗后的传感器的光学图像(两个电极线,即水平线=底电极,垂直线=顶电极,显示相同颜色);(B)在CPl的固定化以及与其标记有Cy3染料的互补靶DNA杂交之后的器件的荧光图像(顶电极和底电极为红色);(C)CPl从底电极的电化学剥离,随后与带有Cy3标记的DNA
7杂交(仅顶电极显示为红色,底电极不显示任何颜色);(D)在CP2的固定化以及与各自的标记有Cy3和FAM染料的互补DNAs’杂交(顶电极显示为红色,底电极显示为绿色)之后的荧光图像。图11(A,上)表示以背景(对照物),(B,中)为校准曲线,(C,下)-V曲线。为清楚起见,将单碱基错配后的靶的i-V曲线放大10倍。误差条表示每组5个测量值的数据的变化。。图13表示SEM图像㈧经银处理后的二氧化硅;⑶在台阶交叉处(即顶电极和底电极之间的台阶)的空白传感器芯片;(C)涂有捕获探针的对照传感器芯片;(D)。图14表示用于RNA检测的感测器件的示意图。图
15表示以背景(对照物)为参照的IOOng总RNA的代表性的i_V曲线。图16图示(1)IOng的总RNA和(2-4)。图17表示电导相对于GAPDH浓度的校准曲线。误差条表示每组5个测量值的数据的变化。
具体实施例方式在第一方面,本发明涉及用于检测核酸分子的传感器。该传感器包括或由下列部件组成电极结构,其包括第一电极、第二电极和重叠区,其中,在重叠区内第二电极的一部分与第一电极的一部分重叠,使得第二电极的顶面水平高于第一电极的顶面水平从而形成阶梯式结构,在第一电极和第二电极之间设有绝缘层,该绝缘层与第一电极和第二电极接触。该传感器还包括固定于第一电极的表面的第一核酸探针和固定于第二电极的表面的第二核酸探针。该传感器的设计考虑了通过使用标准的硅微细加工技术以经济有效的方式而进行批量生产的可行性。该感测机构的基础是当靶核酸(例如DNA或RNA)的两个末端与两个不同的表面束缚的捕获探针杂交时,将在第一电极的顶面和第二电极的顶面之间形成的边缘桥接起来,之后是简单的金属化步骤。例如,,以干净的背景()为参照,获得约两个数量级的电导提升。同样,在一个实施例中,,%突出的信号强度的变化。电导率的这种变化非常大,以致于可明确地对核酸浓度进行定量检测,且可以不需要如在当前
DNA试验中使用的靶扩增。而且,在使用中,由于其独特的垂直排列的纳米结构和两个探针的构造,该传感器表现出优异的单碱基错配识别。针对RNA检测,,观察到不同的电导变化。例如,在一个实施例中,,每个单位浓度伴随着2个数量级以上的突出的信号强度的变化。电导的这种变化非常大,以致于可明确且定量地确定mRNA的表达水平,且对于DNA可以不需要在当前mRNA表达分析试验中使用的靶扩增。例如,在仅有IOng的总RNA中可成功地区分基因表达的低至50%的差异。本发明的传感器中的电极的阶梯式结构可以进行改变,以在电极之间产生具有约50nm约535nm之间的高度的边缘的台阶,其中边缘形成于在重叠区中第二电极(例如参见图2中的150)的顶面与第一电极(例如参见图2中的130)的顶面之间。例如图3(G)所示,电极之间的台阶200的边缘的厚度由第二电极150的厚度和绝缘层140的厚度来确定。在一个实施例中,第二电极和绝缘层的侧面(例如参见图I(B)中Γ、1"和1"’)相对于第二电极的顶面成约80°90°之间的角,或者在一个实施例中,成90°士30°的角或90°士20°的角。这样在重叠区中,第二电极和第一电极之间形成了陡峭的边缘。这允许例如将核酸紧靠边缘的底部固定,于是,即使是与固定于第二电极的顶面和底电极的顶面的紧靠台阶的核酸探针相结合的较短的靶核酸,也能为桥