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专利名称::用于诊断虾病原体的序列的制作方法
技术领域:
:本发明涉及诊断测试领域。更具体而言,已开发了用于检测虾传染性皮下及造血器官坏死病毒病原体的新的引物。
背景技术:
:商业奸养殖场因为大量常见病原体的影响而遭受广泛损失。传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)是最严重的养殖对奸病毒性病原体之一。它广泛分布于许多国家,并且具有广泛的宿主范围。例如,IHHNV引起西方兰奸(Westernblueshrimp)(南美兰只f奸(尸e"aez^s(y/zyostn'力的大量死亡以及太平洋白虫下(Pacificwhiteshrimp)(南美白对奸(尸e"aeusv"""awe/))的变形。IHHNV是小的含单链DNA细小病毒,其完整基因组已经得到测序(Bonami等人,".J/,>o/ogy71(Ptll):657-2664(1990);GenBankAF218266)。IHHNV对于奸养殖业极为有害,是全世界突难性流行病的原因。许将感染虾在进入商业生产体系之前消除。因此,已开发了检测虾中IHHNV的多种方法,包括基于核酸的方法和免疫学方法(Lightner等人,勿膨w/敏164(l):201-220(1998))。核酸扩增方法例如聚合酶链反应(PCR)以及等温扩增方法因其简单、快速和灵敏而备受关注。基于扩增基因组不同诊断区域4企测IHHNV的PCR
方法已有描述(见例如Nunan等人,A/",.5io/ec/"o/.2(4):319画328(2000);Yue等人,J./她簡,/画/89(1):240-244(2006);(2):79画85(2001);Hu等人,CN1410549;以及Dhar等人.《/.C//.39(8):2835-2845(2001))。另外,Sun等人(/.她Ac^131(l):41-46(2006))描述了检测IHHNV的环介导等温方法。上述所有方法均可用于IHHNV^r测;然而,这些方法通常缺乏特异性、灵敏度,或者复杂且耗时。另外,由于病毒中的高基因突变率,针对基因组不同区域的测试将会是有用的。因此,需要快速、准确并且易于使用于本领域的高灵敏度的IHHNV测定。通过基于IHHNV基因组新部分的引物的发现,所述问题在此得到解决。在此鉴定的引物可用于检测IHHNV的引物指导的扩增或核酸杂交测定方法,而不具有前述方法学相关的问题。发明概述在一个实施方案中,本发明提供了SEQIDN0s:l-8任一项中所述的分离的IHHNV诊断引物序列,或者与SEQIDNOs:l-8完全互补的分离的核酸分子。在另一个实施方案中,本发明提供了在此公开的一对不同的两个IHHNV诊断引物序列,其中该对能够引发扩增IHHNV基因组内核酸区域的核酸扩增反应。在另一个实施方案中,本发明提供了检测IHHNV的试剂盒,包括至少一对在此公开的IHHNV诊断引物序列。在另一个实施方案中,本发明提供了检测样品中存在IHHNV的方法,包括
(i)提供来自怀疑含有IHHNV的样品的DNA;以及(ii)在合适的杂交条件下用探针探测该DNA,所述探针来自SEQIDNOs:1-8任一项的分离的IHHNV诊断引物序列;其中可杂交核酸片段的鉴定证实了IHHNV的存在。在其他实施方案中,该检测方法鉴定未被IHHNV感染的DNA样品。在另一个实施方案中,本发明提供了检测样品中存在IHHNV的方法,包括(i)提供来自怀疑含有IHHNV的样品的DNA;以及(ii)用至少一对在此公开的IHHNV诊断引物序列扩增DNA从而产生扩增产物;其中扩增产物的存在证实了IHHNV的存在。在另一个实施方案中,本发明提供了样品中IHHNV量的定量方法,包括(i)提供来自怀疑含有IHHNV的样品的DNA;(ii)在核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针的存在下,用至少一对在此公开的IHHNV诊断引物序列,通过至少变性温度和延伸温度之间的热循环扩增DNA;(iii)测量热循环期间由核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针产生的荧光量;(iv)确定核酸结合荧光试剂或荧光标记的探针产生的荧光量达到基线值以上固定阈值时的阈循环数;并且(v)通过将测得的样品中IHHNV的阈循环数与阈循环数对模板浓度对数的标准曲线进行比较,计算样品中IHHNV的量,所述标准曲线使用已知浓度的标准溶液确定。附图简述及序列描述本发明的各个实施方案可以通过下列详述和附加序列描述而得到更加全面的理解;所述详述和附加序列描述形成本申请的一部分。图1A显示由IHHNV
病毒DNA和肌动蛋白DNA同时PCR扩增形成的IHHNV4产物以及肌动蛋白内部样品对照产物的解链曲线,如实施例10所述。IHHNV和肌动蛋白产物的解链温度(Tm)值显示于其对应解链曲线上。图IB显示含有由IHHNV病毒DNA和肌动蛋白DNA同时PCR扩增形成的IHHNV4产物以及肌动蛋白内部样品对照产物的样品的琼脂糖凝胶电泳分离结果,如实施例IO所述。IHHNV和奸DNA的量显示于各泳道之上;"M"为100-bpDNA梯。-("关于含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则")并且与世界知识产权组织(WIPO)(1998)及EPO与PCT的序列表要求((a-bis)及208节以及管理说明书附件C)一致。.§。SEQIDNOs:l-8是用于检测IHHNV的IHHNV诊断引物的核苷酸序列SEQIDNOs:9-12是实施例一般方法部分中所述的合成IHHNV模板的核苷酸序列。这些序列也是使用在此公开的IHHNV诊断引物对所得扩增产物的核苷酸序列。SEQIDNOs:13-16是实施例10所述内部样品对照引物的核苷酸序列。SEQIDNOs:17和18是荧光标记的探针的核香酸序列。发明详述在此公开的是用于检测传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的测定中的引物。该引物可用于有效检测和定量强毒传染性皮下及造血器官坏死病毒的核酸扩增方法和杂交测定中。在本公开内容中使用了大量术语和缩写。提供下列定义,并应作为权利要求和说明书的解释的参考。
"聚合酶链反应"缩写为PCR。"传染性皮下及造血器官坏死病毒,,缩写为IHHNV。术语"分离的IHHNV诊断引物序列"指与诊断IHHNV存在的IHHNV基因组部分对应的序列。在此所用的"分离的核酸片段"是单链或双链的任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可以包括cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段。术语"扩增产物"或"扩增子"指在引物指导的扩增反应中产生的核酸片段。一般的引物指导的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或其它等温扩增过程。如果选择PCR方法,则复制组合物通常将包括例如脱氧核苷酸三磷酸、具有合适序列的两个引物、热稳定DNA聚合酶和蛋白质。,683,202(1987,Mullis,等人),683,195(1986,Mullis,等人)中提供了这些试剂及描述其用于扩增核酸的程序的细节。如果选择LCR方法,则核酸复制組合物将包括例如热稳定连接酶(例如水生栖热菌("cuy)连接酶),两套邻近的寡核苦酸(其中每套中的一个成员与各自耙链互补)、Tris-HCl緩冲液、KC1、EDTA、NAD、二石克苏糖醇和鲑精DNA(见例如Tabor等人,尸亂淑/.爿cat/.",82:1074-1078(簡))。术语"引物"指寡核苷酸
(合成的或自然存在的),当处于由聚合酶催化互补链合成的条件下时,所述寡核苷酸能够起到核酸沿互补链合成或复制的起始点的作用。术语"热循环,,指某种核酸扩增方法例如PCR和LCR中采用的改变温度的完整模式。该过程是常见的且为本领域所公知的。见例如Sambrook,J.,Fritsch,,T.,M/ecw/arC7cw/"g..JZ/a6on2/o,少A/awwa/,第二片反,ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NY(1989);,683,,683,195。总体而言,PCR热循环包括高温下的起始变性步骤、随后为经过设计以允许模板变性、引物退火以及退火引物被聚合酶延伸的温度循环的重复系列。术语"阈循环数",在此也称为"CT",指热循环过程中由于产物形成导致的荧光量达到基线值上固定阈值的循环数。术语"探针"指寡核苷酸(合成的或自然存在的),其与靶序列显著互补、并且与靶序列的至少一条链杂交形成双链体的结构,其中耙序列在此也称为片段(即待检测序列或待检测序列的部分)。可以使用例如荧光标记或配体标记将纟果针标记以便才企测。术语"复制抑制剂部分"指与寡核苷酸3,末端羟基附着、将阻断核酸链复制链延伸起始的任何原子、分子或化学基团。实例包括但不限于3'脱氧核苷酸(例如蛹虫草菌素)、双脱氧核苷酸、磷酸盐、配体(例如生物素和二硝基苯酚
)、报道分子(例如荧光素和罗丹明)、碳链(例如丙醇)、错配核苦酸或多核苷酸,或肽核酸单元。术语"非参与性的"指探针或引物在核酸分子扩增反应中缺乏参与。具体而言,非参与性探针或引物是不作为DNA聚合酶的底物或不被其延伸的探针或底物。"非参与性探针"先天不能被聚合酶链延伸。其可能具有或可能不具有复制抑制剂部分。当核酸分子的单链形式可在稳定的温度和溶液离子强度条件下与其他核酸分子退火时,核酸分子能够与另一个核酸分子例如cDNA、基因组DNA或RNA杂交。杂交和洗涤条件广为人知,并示例于Sambrook,丄,Fritsch,,/^rC7om'wg.'」Z^0raM7Mmwa/,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor:NY(1989),(在此完整引用作为参考)。温度和离子强度条件决定杂交的"严格性,,。对于同源性核酸的初步筛选,可以使用对应于55。C解链温度(Tm)的低严格性杂交条件,例如5XSSC,%SDS,%乳且无曱酰***;或30%曱酰***,5XSSC,%SDS。中等严格性杂交条件对应于更高Tm,例如40%曱酰***和5X或6XSSC。尽管取决于杂交的严格性,碱基之间的错配是可能的,但杂交'要求两个核酸含有互补序列。合适的核酸杂交严格性取决于核酸长度和互补程度,本领域所公知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高,具有这些序列的核酸的杂交体
Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按照下列顺序降低RNA:RNA,DNA:RNA,DNA:DNA。对于长度在100个核苷酸以上的杂交体,推理出了计算Tm的等式(见Sambrook等人,同上,-)。对于较短的核酸即寡核苷酸的杂交,错配的位置变得更为重要,而寡核苷酸长度决定其特异性(见Sambrook等人,同上,-)。在一个实施方案中,可杂交核酸长度为至少约10个核苷酸。优选的,可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸,更优选至少约20个核苷酸;且最优选长度为至少30个核苷酸。此外,技术人员将认识到可以根据例如探针长度的因素对温度和洗涤溶液盐浓度进行必要调整。"基因"指表达特定蛋白质的核酸片段,包含编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。"天然基因"指在自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。"嵌合基因"指非天然基因的任何基因,包括没有在自然界被一同发现的调节和编码序列。因此,嵌合基因可以包括来自于不同来源的调节序列和编码序列,或者来自于相同来源,但是按照与其发现于自然中的不同方式排列的调节序列和编码序列。"内源基因"指在其生物基因组内自然位置的天然基因。"外来"基因指通常不发现于宿主生物内,但是通过基因转移而引入宿主生物内的基因。外来基因可以包括插入到非天然生物内的天然基因或嵌合基因。"转基因"是已通过转化程序引入基因组中的基因。术语
"可操作地连接的"指核酸序列结合在单独一个核酸片段上,因此一个的功能受另一个影响。例如,当启动子能够影响编码序列表达时,该启动子与所述编码序列可操作地连接(即,编码序列在该启动子转录控制之下)。编码序列可以以有义或反义方向与调节序列可操作地连接。如此处所使用的术语"表达,,指来自本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指将mRNA翻译为多肽。)"指经常携带非细胞中心代谢部分的基因、且通常为环状双链DNA分子形式的染色体外元件。这种元制;列、基因组i合^列、、谨i体或核苦J序列,其^许^核普酸序列被连接或重组为独特结构,所述独特结构能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3,非翻译序列一起引入细胞。"转化盒"指含有外来基因并除外来基因之外具有帮助特定宿主细胞转化的元件的特定载体。"表达盒"指含有外来基因并除外来基因之外具有允许所述基因在外来宿主内表达增强的元件的特定载体。术语"序列分析软件"指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。"序列分析软件"可以通过商业途径获得或独立开发。一般的序列分析软件将包括但不限于程序GCG组(,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI),BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等人,/.S/o/.215:403-410(1990),DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)
,。在本申请背景下,除非另有说明,将理解为,当序列分析软件用于分析时,分析结果将基于程序引用的"默认值"。此处所用的"默认值"意味着在首次初始化时软件最初加载的任一套值或参数。在此使用的标准重组DNA及分子克隆技术为本领域所公知,并且描述于Sambrook,J.,Fritsch,,T.,M/ecw/arC7画."g:爿Z^6orator少Mwwa/,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NY(1989)(下文为"Maniatis,,);以及Ausubel,,Cw/rewf/V自co/s&Mo/ecw/arBz'o/ogy,-Interscience(1987)出版。传染性皮下及造血器官坏死病毒基因组传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)是具有高死亡率和广泛宿主范围的主要虾病原体。IHHNV的完整基因组已被测序(Bonami等人,".F/ro/ogy71(Pt11):657-2664(1990);GenBankAF218266)。该基因组由含有4,075个碱基和3个可读框(ORFs)的单链DNA组成。IHHNV诊断引物序列使用一系列"在计算机芯片上"(即基于计算机的)序列分析工具经验性鉴定引物序列。在此过程中,组装含有所有已知IHHNV序列的数据库。首先将这些序列进行比对,然后基于与其他