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用于细菌的多顺反子表达系统的制作方法本发明涉及革兰氏阳性菌中的多顺反子表达,并且特别地涉及多顺反子表达单元,所述多顺反子表达单元包含与对革兰氏阳性菌外源的一个或更多个基因转录偶联的对所述细菌内源的一个或更多个基因。【专利说明】用于细菌的多顺反子表达系统【
技术领域:
】[0001]本发明属于生物学和医学的领域,更特别地属于分子和细胞生物学的领域,并且涉及通过微生物重组改造和表达产物,例如肽、多肽或蛋白质。更特别地,本发明涉及用于通过微生物表达这样的产物的多顺反子表达构建体或盒,并且还涉及载体、经转化宿主、用途和应用,例如向患者递送(尤其是治疗性递送)如此表达的产物。【
背景技术:
】[0002]迄今为止,已开发了重组蛋白的多种表达系统用于多种生物技术应用。在原核生物、酵母和真菌中并且在哺乳动物细胞中已建立了用于异源或同源基因表达的系统。[0003]使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为宿主系统表达了酵母中产生的大多数重组蛋白。尽管如此,还是在酿酒酵母系统中发现了一些限制。例如产率通常低和分泌效率低(发现许多酿酒酵母蛋白质在培养基中不是游离的,而是保留在周质空间中或者与细胞壁缔合)(Dominguez
.,1998,(2),131-142)。由于在酵母中进行生产的限制,对于在细菌中表达蛋白质产生了很大的兴趣,细菌易于在廉价培养液中生长并经常用于生产重组蛋白。在原核系统中,使用大肠杆菌()中的重组表达通常得到最高的蛋白质水平(Jana&.,2005,(3),289-298)。但是,在大肠杆菌中,最常用的生产策略是细胞内的(在周质或胞质中),因此涉及昂贵且经常产生问题的下游纯化过程。[0004]作为用于在体外重组表达异源多肽(例如,US5,559,007)以及用于在体内或原位表达并递送抗原和/或治疗相关多肽(例如,WO97/14806)的宿主,乳酸菌(LacticAcidBacteria,LAB)变得越来越重要。这些革兰氏阳性菌宿主中产生的异源蛋白质可容易地分泌到培养基中,从而有助于其纯化以及其向对象的直接递送。[0005]大多数表达系统可非常好地处理单一蛋白质的表达(由单一基因序列引起)。但是,在一些情况下期望存在这样的表达系统,其能够表达多种蛋白质或多基因蛋白质复合体,例如,不仅在体外表达抗体或蛋白质复合体,而且在体内或原位表达并递送对具体疾病具有协同效应的两种或更多种蛋白质,或者在体内或原位表达并递送抗体或其功能性(多基因)片段。在这些情况下,由于必须严格共同调控多个基因,所以期望存在在一个启动子控制下编码期望蛋白质或抗体的多个基因。
[0006]产生重组蛋白质复合体的两种最常见途径是使单独表达并纯化的亚基进行体外重组,或者通过在适当宿主中共表达亚基来实施体内重组(Selleck&Tan,“,,,.,2008,第5章:第5单元,21)。虽然体外重组已被成功使用,但是该方法是繁琐的(必须表达并纯化每个亚基,并且在重组之后必须进一步纯化复合体)并且重组产率通常较低。相比之下,通过共表达进行体内重组提供了效率的益处(仅一轮表达和纯化)以及期望复合体的潜在较高产率和质量(复合体的再折叠和装配在细胞环境中在蛋白质折叠酶存在下发生)(SelleCk&Tan2008,见上)。通过用表达各蛋白质亚基的杆状病毒共感染昆虫细胞(,1999,(I),87-95),以及在细菌中由多个质粒(.,2000,(3),435-443;,1988,(19),7270-7273)或专门化的多顺反子质粒(.,1994,(15),II121-1I132;Ishiai等?,(34),20868-20878;Li等?,1997,(6),2278-2283)
成功进行了体内重组。[0007]已描述了用于在大肠杆菌中产生蛋白质复合体的一般多顺反子表达系统(Selleck&Tan2008,见上;.,2001,(1),224-234;Tan等?.,2005,(2),385-395)。这些系统利用了翻译盒的概念,所述翻译盒由具有需要的起始密码子和终止密码子的编码区以及之前的翻译起始信号例如夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno(SD))序列和翻译增强子(Tan2001,Tan等?2005,见上)构成。当转录成mRNA时,翻译盒包含使大肠杆菌翻译机构启动并维持mRNA翻译成期望多肽的必需且足够的信息(Selleck&Tan2008,见上)。[0008]虽然在大肠杆菌中已描述了用于白细胞介素18的双顺反子表达载体,但是两个基因之间的基因间区域由合成接头组成,并且其具有明显的基因特异性因为胱天蛋白酶-4的表达比ICE的表达高得多。Smolke等之前证实了可使用合成基因间区域序列来差异性控制由操纵子的两种或更多种基因编码的蛋白质水平(.,2000,(12),5399-5405;SmoIke&.,2002,(7),762-776)。但是,该途径依赖于随机组合,并且需要将合成序列引入表达宿主中。[0009]近些年来对新的改良抗体生产系统的需求增加。在原核生物、酵母和真菌中并且在哺乳动物细胞中已建立了用于抗体表达的系统。虽然由细菌更容易产生单链抗体和单结构域抗体,但是全尺寸抗体一般具有更高的结合亲和力和更小的在注射时形成中和抗体的风险。
[0010]可由细菌产生全尺寸抗`体(.,2007,(5),563-565;Simmons等?,2002,(1-2),133-147)。关于重组原核表达的大多数报道描述了抗体片段的产生,虽然几乎仅由大肠杆菌产生。虽然多种经改造LAB能够发生正确的二硫键连接,但是文献仅包含由LAB产生的抗体样分子的有限个数的实例(,2002,(7),702-706;,2000,(10),1060-1064;Chancey等?.,2006,(9),5627-5636;.,2007,,58;Yuvarai等?.,2008,(8),913-920)。这些报道仅描述了在乳杆菌(Lactobacillus)物种、乳酸乳球菌(LactococcusIactis)和格氏链球菌(Streptococcusgordonii)中表达的单链抗体片段,而没有描述多基因的双链抗体片段或全尺寸抗体。[0011]多顺反子表达系统在得到复杂蛋白质如抗体的有效原核合成和表达中可以是至关重要的。自从FDA在1986年批准了莫罗单抗-⑶3(Muromonab-⑶3)(
仍然是可用于控制移植排斥的最有效免疫抑制药之一)(,1991,(1),26-37)以来,全尺寸抗体和抗体片段成为了医药中越来越重要和通用的工具。[0012]虽然现有技术水平揭示了细菌细胞中多顺反子表达系统的几个实例,但是这些是相当有限的,突出了对用于引入和表达多个基因的更有效系统的需要。因此,有需要提供可有利地用于蛋白质表达,优选异源蛋白质表达,并且甚至更优选地多种异源蛋白质表达的另外的序列。[0013]除以上之外,产生更高量的重组蛋白(对于通过重组微生物的直接蛋白质递送以及大量(bulk)蛋白质生产和下游纯化二者)的尝试代表了大的技术努力方向。增加异源蛋白质产量的一种现有途径是使用所选择的强启动子(参见例如WO2008/084115)。在这种途径中,进行蛋白质组学分析以鉴定由微生物表达的最丰富的内源蛋白质。通过使用基因组序列,可鉴定和分离各基因和启动子。这些强启动子(例如,乳酸乳球菌hllA基因启动子,PhllA)可定位在异源基因之前,并且通过这种方式可实现高表达。但是,损害宿主生理机能的表达水平可对宿主构成生长负担并导致反选择(counter-selection)。这固有地将表达宿主中任意给定异源蛋白质的最高可能表达限制在某一特定水平。这是染色体定位表达单元的开发中特别麻烦的障碍。[0014]传统地通过提供选择标志物来解决反选择的问题。的确,阳性选择或阴性选择
(例如,通过提供抗生素抗性基因)可防止引入的异源基因丢失。可替代地或者除使用选择标志物之外,可采用诱导型基因表达系统,其允许使宿主繁殖与异源蛋白质的表达的解偶联,从而在异源基因不表达时防止繁殖期期间可能的反选择。在该背景下,EP0569604描述了嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)中的诱导型表达系统,其中异源基因强制性定位在LacZ基因的5’。通过这种方式,异源基因的表达不仅是诱导型的,而且另外通过使细菌在其自然栖息地乳中以乳糖作为碳源生长(这需要表达LacZ基因)来选择异源基因的保持。[0015]清楚的是,以上描述的用于异源基因表达的系统在应用中受到限制。例如,使用选择标志物例如抗生素抗性基因不太容易为食品生产中的应用或药剂应用所接受。此外,在自然栖息地生长或使用来自生长自然栖息的碳源生长的限制显著减少了用于异源基因表达的任意系统的多功能性。另外,诱导型系统的使用固有地取决于宿主的生长条件,使得需要应添加诱导物的限定培养基以确保异源蛋白质的表达。[0016]因此,本领域中还存在对增加异源蛋白质表达的需要,并且需要可实现高表达水平的序列、克隆系统和策略,以得到工业和/或治疗环境下以足够量表达并且同时在多种不同条件下是通用的并且可广泛使用的异源蛋白质。在这些环境中,还特别有用的是得到多种蛋白质的表达,每一种具有其自身的生物学活性和
治疗性作用。【
发明内容】[0017]本发明的方面和实施方案解决了以上所讨论的本领域需要中的至少一些需要,例如一种或更多种需要。[0018]本发明人出乎意料地发现,革兰氏阳性菌可通过也包含这些细菌的内源基因的多顺反子表达单元有效地表达外源或异源基因。因此,当外源或异源基因与革兰氏阳性菌的内源基因转录或翻译偶联时,这些细菌可由多顺反子表达单元有效地表达所述外源或异源基因。出乎意料地,本发明人发现,多顺反子表达单元中内源基因与外源基因的转录和/或翻译偶联(transcriptionaland/ortranslationalcoupling)导致了革兰氏阳性菌中外源基因的高表达水平。特别地,发现跟不与革兰氏阳性菌内源基因转录或翻译偶联的外源基因的表达水平相比,与革兰氏阳性菌内源基因转录和/或翻译偶联的外源基因的表达水平至少与其相当并且有利地更高。[0019]因此,在本发明的一方面涉及包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌,所述多顺反子表达单元包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。因此,多顺反子表达单元也可表示为包含内源基因(例如但不限于一个内源基因)和一个或更多个外源基因。优选地,多顺反子表达单元连续地包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。因此,这样的多顺反子表达单元也可表示为连续地包含内源基因
(例如但不限于一个内源基因)和一个或更多个外源基因。多顺反子表达单元被构造成实现一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因转录为多顺反子mRNA。因此,本发明革兰氏阳性菌可另外地表示为包含与一个或更多个外源基因转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因。因此,还提供了包含与一个或更多个外源基因转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因的革兰氏阳性菌。[0020]另一个方面提供了包含多顺反子表达单元的重组核酸,所述多顺反子表达单元包含对革兰氏阳性菌内源的基因和一个或更多个对革兰氏阳性菌外源的基因。优选地,多顺反子表达单元连续地包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。因此,还提供了包含多顺反子表达单元的的重组核酸,所述多顺反子表达单元包含与一个或更多个对革兰氏阳性菌外源的基因转录和/或翻译偶联的一个或更多个对革兰氏阳性菌内源的基因。[0021]优选地,如本说明书全文所意图的,所述一个或更多个外源基因可与所述一个或更多个内源基因的3’末端转录或翻译偶联。本发明人出乎意料地发现,这样的构造在异源蛋白质表达水平,多顺反子表达单元的维持和/或基因组稳定性方面是有益的。而且发现其他的下游基因组布置的重要性较小或不重要。[0022]转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的转录可被能够在革兰氏阳性菌中实现转录的启动子合适地调节或控制,并且优选地可被所述革兰氏阳性菌的内源启动子调节或控制。因此,还提供了这样的革兰氏阳性菌,其包含与位于其天然染色体基因座的一个或更多个
`内源基因转录或翻译偶联的一个或更多个外源基因。因此,优选地,这些转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的转录被所述一个或更多个内源基因的天然启动子控制或调节。合适地,转录或翻译偶联可通过将一个或更多个外源基因染色体整合到所述基因座来实现,例如通过将一个或更多个外源基因染色体整合到所述基因座中所述一个或更多个内源基因的3’来实现。[0023]因此,在一个方面中,本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌,所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述一个或更多个内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因,优选地,其中所述一个或更多个外源基因是多顺反子表达单兀的最3’基因。[0024]本发明人出乎意料地发现,转录偶联到天然基因(其自身可以是多顺反子基因,例如操纵子)3’的外源或异源基因(或多个异源基因)的染色体整合产生稳定的表达单元,其中针对(一个或更多个)外源基因的反选择不存在或最小,这与预期的相反。[0025]本发明人出乎意料地发现,当在某些条件下(特别是通过某些类型的启动子)实现多顺反子表达单元的表达时,更加体现出本文描述的优点。本发明人出乎意料地发现,本文所述的多顺反子表达系统